第十二章核酸的生物合成◆第一節DNA復制的一般規律◆第二節與DNA復制有關的酶和蛋白質因子◆第三節原核生物DNA復制的分子機制◆第四節真核生物DNA的復制◆第五節反轉錄（RNA指導的DNA聚合）◆第六節DNA的修復◆第七節轉錄與“加工”◆第八節

重組DNA技術1ppt課件第十二章核酸的生物合成

第一節DNA復制的一般規律2ppt課件一、DNA復制是半保留的由Watson和Crick的DNA雙鏈結構所設想的三種DNA復制模型圖3ppt課件二、證明DNA復制是半保留的方式的Meselson和Stahl實驗4ppt課件三、DNA復制是單向或雙向進行E.coli染色體的雙向復制5ppt課件復制叉前進的方向6ppt課件7ppt課件四、復制是半不連續的DNA復制的半不連續模型圖返回8ppt課件第二節與DNA復制有關的酶和蛋白質因子一、DNA聚合酶（DNA復制酶）E.coliDNA聚合酶性質9ppt課件1、E.coliDNA聚合酶Ⅰ

由單一多肽鏈構成的E.ColiDNA聚合酶Ⅰ有三個活性位點10ppt課件ArthurKornbergwonthe1959NobelPrizeinMedicineforhisdiscoveryofthemechanisminthebiologicalsynthesisofdeoxyribonucleicacid(beforeWatsonandCrickwontheirs!)11ppt課件（1）DNA聚合酶Ⅰ催化的DNA鏈延伸反應(5，—3，的聚合活性）12ppt課件（2）、DNAⅠ聚合酶具有校正與編輯屬性（E.coli）13ppt課件（3）DNA聚合酶Ⅰ的3’-5’外切核酸酶活性從生長的DNA鏈3’端切除錯配堿基14ppt課件（4）DNA聚合酶Ⅰ的切除與修復模式15ppt課件（5）、聚合過程需要模板（DNA）（6）、聚合過程需要引物（RNA）16ppt課件2、大腸桿菌的三種DNA聚合酶（1）、DNA聚合酶Ⅰ（2）、DNA聚合酶Ⅱ（3）、DNA聚合酶Ⅲ17ppt課件3、大腸桿菌DNA聚合酶的比較項目Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ結構基因polApolBpolC亞基數1≥4

≥10分子量103000880008300003-5外切有有有活性5-3外切有無無活性18ppt課件多聚化速度16-2040250-1000（核甘酸/秒）連續性（解離前補加核甘酸3-2001500≥500000數）19ppt課件大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的亞基亞基全酶中的亞基數分子量α213200ε227000θ

210000τ

271000γ

252000δ

13500020ppt課件δ133000χ115000ψ112000β43700021ppt課件

基因亞基的功能polC(dnaE)多聚化活性dnaQ(mutD)3-5外切酶核心聚合酶holE活性(校正)dnaX穩定模板結合核心酶二聚化dnaX*holAholB“鉗”安置復合物holCholDdnaN增加復制連續性DNA的“鉗”22ppt課件23ppt課件4、DNA連接酶的作用機理24ppt課件5.E.coliDNA復制中所涉及的蛋白質蛋白質亞基數目功能DnaA1識別起點序列,在起點特異性位置解開雙鏈DnaB6解開DNA雙鏈DnaC1幫助DnaB結合于起點HU2類組蛋白,DNA結合蛋白,促進起始引物合成酶(DnaG)1合成RNA引物單鏈結合蛋白(SSB)4結合DNA單鏈RNA聚合酶5促進DnaA的活性DNA旋轉酶(拓撲酶Ⅱ)4釋放DNA解鏈過程中產生的扭曲張力Dam甲基化酶1使起點GATC序列的腺嘌呤甲基化25ppt課件E.coliDNA復制中所涉及的蛋白質返回26ppt課件第三節原核生物DNA復制的分子機制原核生物DNA的復制包括：1、起始2、延伸3、終止127ppt課件一、DNA復制的起始1、復制的起點

大腸桿菌的復制起點為oriC，是由245個堿基對組成，這些序列在大多數細菌中是高度保守的，關鍵序列是3個13bp和4個bp的重復序列。DnaA蛋白結合的4個9bp順序3個13bp串聯重復序列交感順序交感順序28ppt課件2、有9個蛋白和酶參與復制的起始DnaA蛋白識別原點順序在特定位點上打開DNA雙鏈DnaB蛋白DNA解螺旋DnaC蛋白幫助DnaB蛋白與原點結合HU刺激復制起始引物酶DnaG蛋白合成RNA引物SSB結合單鏈DNARNA聚合酶促進DnaA蛋白激活DNA旋轉酶釋放解螺旋時產生的張力Dam甲基化酶甲基化原點的5GATC序列29ppt課件A、20個各帶1個ATP的DnaA蛋白結合于9bp順序，使DNA圍繞著復合物卷成一圈B、三個富含A=T的序列13bp重復序列被變性C、在DnaC蛋白的幫助下DnaB蛋白進一步使DNA解螺旋，以備引物和DNA的合成起始復合物開放復合物預引復合物引發復制30ppt課件3、SSB結合單鏈DNASSB結合單鏈DNA，防止分開的DNA單鏈重新締合。防止分開的DNA單鏈被DNA酶水解。31ppt課件4、DNA旋轉酶釋放解螺旋時產生的張力32ppt課件5、形成復制叉

在原點處通過解旋、解鏈和SSB蛋白的結合等過程形成復制叉。33ppt課件二、DNA新鏈的延伸34ppt課件1、引發—RNA引物的合成在引發體（引物酶、DnaG的作用下）在原點處合成一小段RNA引物（10-60個堿基），然后由DNA聚合酶Ⅲ合成DNA鏈。前導鏈合成一個引物，滯后鏈斷續合成多個引物。35ppt課件2、DNA新鏈的延伸新鏈延伸的速度是1000核甘酸/秒36ppt課件37ppt課件38ppt課件3、引物的消除和缺口的補充39ppt課件4、DNA片段的連接40ppt課件三、DNA復制的終止過程1、終止區域大腸桿菌DNA上存在多重拷貝的Ter順序,這種Ter順序長20bp,包括TerA、TerB、TerC、TerD、TerF和TerG，它們在DNA上排列以創造出一種“陷阱”,阻止復制叉的移動。防止過分復制。41ppt課件三、DNA復制的終止過程42ppt課件逆時針復制叉順時針復制叉逆時針復制叉陷阱11順時針復制叉陷阱43ppt課件2、當任意一個復制叉碰到一個功能性Tes-Tur復合物時，就停止。而另一個復制叉碰到第一個被阻止的復制叉時也停止前進。這些大復合物中間的幾百個核甘酸對以一種未知的機制被復制。完成兩個環行染色體的拓撲學聯系。分開這種連環需要拓撲異構酶Ⅳ。返回44ppt課件第四節、真核生物DNA的復制一、自體復制順序（ARS、原點、復制子）真核生物（酵母）ARS約有150個bp，含有幾個保守序列，在單倍體酵母細胞的17條染色體中有400個ARS因子，這表明在真核生物DNA中有多個復制的起點。真核生物DNA的復制的起始還需要一個原點識別復合物（ORC），受控制真核生物細胞周期的蛋白質的調控。45ppt課件二、存在復制叉真核生物DNA復制過程中也出現復制叉，而復制叉的移動速度較原核生物慢，僅為原核生物的1/20，（約50nt/秒）。三、DNA聚合酶真核生物DNA聚合酶有：1、DNA聚合酶α，負責染色體DNA的復制。該酶大亞基負責聚合，小亞基負責引物的合成，由于缺乏3-5的外切活性，可能參與滯后鏈RNA引物的合成。2、DNA聚合酶δ負責DNA鏈的延伸，該酶需要增殖細胞核抗原（PCNA）來協助。其主要46ppt課件功能類似于原核生物DNA聚合酶的β亞基，形成一個環行的鉗子，增加DNA聚合酶δ復制的連續性。3、DNA聚合酶β主要負責核DNA的修復。4、DNA聚合酶ε除去岡崎片段上的引物，負責核DNA的修復。5、DNA聚合酶γ負責線粒體DNA的復制。

RFA

是真核生物的DNA單鏈結合蛋白

RFC

促進復制復合物的組裝。47ppt課件四、也有岡崎片段

100-200個（核甘酸）五、需要DNA連接酶六、端粒的復制線形DNA的末端為端粒，是在端粒酶的作用下完成的。端粒酶是一種RNA酶。48ppt課件染色體末端復制-端粒與端粒酶后隨鏈中RNA引物的切除與gap產生及由端粒酶對DNA5’端的延長49ppt課件PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)同源三聚體結構、50ppt課件真核DNA復制模型（示聚合酶開啟與后隨鏈崗崎片段過程）51ppt課件七、DNA復制的忠實性在大腸桿菌DNA的復制中，每聚合10的9次方到10的10次方個堿基的才出現一個錯誤。1、堿基配對原則2、引物RNA的作用3、DNA聚合酶的校正閱讀作用返回52ppt課件第五節反轉錄（RNA指導的DNA聚合）一、反轉錄（逆轉錄）是以RNA為模板合成DNA的過程。反轉錄酶的酶活性1.RNA指導的DNA聚合酶活性2.RNaseH活性3.DNA指導的DNA聚合酶活性4、需要引物53ppt課件二、反轉錄酶及其作用過程54ppt課件一、突變導致腫瘤發生1、突變DNA核甘酸順序的永久性改變2、點突變用一個堿基對替換另一個堿基對的突變。3、插入作用或缺失作用增加或缺失一個堿基對或多個堿基對的突變。4、沉默突變突變影響非必需DNA或突變對一個基因功能的影響是可以忽略的。5、回復突變有些突變可以克服第一次突變造成的影響。第六節DNA的損傷和修復55ppt課件基于誘變作用的致癌物檢測A、極少數菌出現在無組氨酸培養基上。B、C、D、加入含有誘變劑的濾紙。56ppt課件二、DNA的損傷

一個哺乳動物基因組24小時內可以積累成千上萬個DNA的損傷，但由于DNA修復的結果，一千個這種損傷只有一個沒有被修復而成為突變。57ppt課件三、DNA的修復（一）、錯配修復錯配修復依賴模板鏈提供的信息。因此、生物體必須有一個區分模板鏈和新合成鏈的機制，細胞往往采用甲基化的方式來為模板鏈加上標簽。甲基化位置在GATC序列的A上。58ppt課件1、原核生物DNA的錯配修復機理原核生物DNA的錯配修復需要12種以上的蛋白質（1）、甲基指導的DNA錯配修復早期階段的模型59ppt課件（2）、甲基指導的DNA錯配修復完成

60ppt課件（二）、堿基切割修復61ppt課件（三）、核甘酸切割修復62ppt課件五、重組修復與差錯修復63ppt課件64ppt課件65ppt課件66ppt課件67ppt課件68ppt課件69ppt課件70ppt課件71ppt課件72ppt課件73ppt課件74ppt課件75ppt課件第七節、轉錄與“加工”

1958年Crick所提出的分子生物中心法則圖解76ppt課件模板鏈和非模板鏈模板鏈、負鏈、無意義鏈用作RNA合成模板的鏈非模板鏈、正鏈、有意義鏈、編碼鏈互補于模板鏈的DNA鏈。77ppt課件一、原核生物轉錄過程1）、E、coliRNA聚合酶結構與功能（1）E、coliRNA聚合酶的組成由α2ββω由核心亞基和σ因子組成（2）、coliRNA聚合酶負責所有RNA的合成（一）、轉錄以DNA為模板合成RNA的過程

1、原核生物的轉錄78ppt課件RNA聚合酶結構與功能a2bb’s79ppt課件80ppt課件81ppt課件2）、啟動子E.coli起動子的代表性序列82ppt課件3）、原核生物轉錄步驟（1）、RNA聚合酶全酶結合于啟動子部位（2）、聚合作用的起始（3）、鏈的延伸（4）、鏈的終止83ppt課件（1）、起始：閉合啟動子復合物的形成開放啟動子復合物的形成84ppt課件（2）、原核生物轉錄中鏈延伸期過程85ppt課件86ppt課件87ppt課件（3）、終止依賴ρ因子的終止不依賴ρ因子的終止88ppt課件E.colitrp操縱子終止位不依賴ρ因子的終止89ppt課件90ppt課件2、轉錄終止的ρ因子作用機理91ppt課件（2）真核生物轉錄過程1）、真核生物RNA聚合酶（1）、RNA聚合酶Ⅰ負責rRNA(5.8S、18S、28S)的轉錄

（2）、