血清蛋白聚丙烯酰胺電泳第1頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實驗目的＊學習聚丙烯酰胺凝膠電泳原理＊掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術第2頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)電泳的含義

帶電的膠粒或大分子在外加電場中，向帶相反電荷的電極作定向移動的現象稱為電泳。

電泳的應用

1.分離各種有機物：如蛋白質、酶、核酸等

2.分析某種物質的純度及分子量

3.電泳技術與層析法結合可用于物質的結構分析

4.免疫電泳可提高對蛋白質的鑒別能力二、實驗原理第3頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月待分離大分子的性質：所帶的電荷、分子大小和形狀。分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。電場強度：過高，產熱，蛋白變性導致不能分離；緩沖液水分蒸發(fā)過多，離子強度增加；過低，電泳時間增加，擴散。當需要增大電場強度以縮短電泳時間時，需附有冷卻裝置。電滲：在電場中液體對固體支持物的相對移動；當電滲方向與電泳方向一致時，會加快顆粒泳動速度，反之，當兩者方向相反時，會減慢顆粒泳動速度。電泳的影響因素第5頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月支持介質的篩孔：篩孔越小，則顆粒在移動的過程中所受到的阻力也就越大。緩沖液pH和離子強度：pH值距離其等電點愈遠，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大；但是pH過高或過低引起蛋白變性；緩沖液通常要保持一定的離子強度，強度過低，則緩沖能力差，不易維持pH恒定，離子強度過高，在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層（即離子氛），降低了蛋白質的帶電量，使電泳速度減慢。一般所用離子強度為0.02～0.2之間。第6頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)聚丙烯酰胺凝膠電泳

以聚丙烯酰胺凝膠作支持介質的一種電泳方法,由丙烯酰胺(Acr)單體和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下，聚合交聯而成的三維網狀結構凝膠。當Acr和Bis遇到自由基時，便能聚合。引發(fā)自由基產生的方法有兩種：化學法和光化學法.第7頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月1.凝膠聚合催化體系

化學聚合的引發(fā)劑是過硫酸胺（簡稱AP）。在催化劑N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（簡稱TEMED）的作用下，由AP形成氧自由基而引發(fā)聚合反應，由于反應需要TEMED的游離堿基，所以在低pH下，聚合反應可能延遲甚至被阻止。增加TEMED或過硫酸銨濃度可以增加聚合反應速度，但速度過快影響制板操作，兩者濃度過高也影響蛋白質活性。第8頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

（1）光催化：核黃素

（2）化學催化：AP-TEMED催化體系TEMED（四甲基乙二胺）催化AP（過硫酸胺）生成硫酸自由基：S2O82－

2SO4·ˉ硫酸自由基的氧原子激活Acr單體并形成單體長鏈：第9頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月Bis將單體長鏈間連成網狀結構：

第10頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

化學聚合的凝膠孔徑較小，常用于制備分離膠，重復性好。聚合反應受各種因素的影響：?

催化劑和加速劑的濃度?

pH

堿性條件?

溫度

?

分子氧?

雜質第11頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月分子量范圍

適用的凝膠濃度/(%)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 蛋白分子量范圍與凝膠濃度的關系2.凝膠濃度的選擇與被分離物質分子量密切相關

第12頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

3.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g；(6)凝膠孔徑可調節(jié)，根據被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。第13頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月4.聚丙烯酰胺凝膠種類(1)連續(xù)系統與不連續(xù)系統兩大類

不連續(xù)系統:是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離，既存在電荷效應，也有分子篩效應。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。

(2)常用的多為圓盤電泳和板狀電泳，原理完全相同。第14頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

(3)不連續(xù)體系:電極緩沖液、濃縮膠及分離膠濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。第15頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

1)樣品濃縮效應

A.凝膠孔徑不連續(xù)性

B.緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

C.電位梯度的不連續(xù)性

2)分子篩效應

3)電荷效應(4)不連續(xù)體系凝膠對蛋白的分離作用第16頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月三.實驗器材1、電泳儀,電泳槽及其附件2、培養(yǎng)皿3、脫色搖床4、燒杯5、移液槍6、吸量管7、槍頭等第17頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月四.實驗試劑

(參考P121)人血清；分離膠緩沖液：Tris-HCl緩沖液PH8.9；濃縮膠緩沖液:Tris-HCl緩沖液PH6.7；分離膠貯液:Acr28.0g,Bis0.735g,無離子水溶解定容至100ml；濃縮膠貯液:Acr10.0g,Bis2.5g,無離子水溶解定容至100ml；1.6%過硫酸銨溶液:1.6g過硫酸銨溶于100ml無離子水中；電泳緩沖液:Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3,用時稀釋10倍；1%考馬斯亮藍G-250；6%乙酸溶液；40%蔗糖溶液；0.1%溴酚藍溶液

第18頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)垂直平板電泳槽的安裝(二)凝膠的制備(三)加樣(四)電泳(五)固定和染色(六)脫色五.操作步驟第19頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月(一).垂直平板電泳槽的安裝第20頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

(二).凝膠的制備名稱分離膠緩沖液分離膠貯液1.6%過硫酸胺（AP）無離子水體積比例1（2號）2（4號）1（6號）4取量mL1214分離膠的制備(7%)配8mL迅速混勻取6mL沿壁加樣,基本上加到2/3處,再取大約3mL水加在上面補滿覆蓋室溫靜置30min(烘箱37度,凝聚速度快)第22頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠貯液1.6%過硫酸胺（AP）40%蔗糖體積比例1（3號）2（5號）1（6號）4(9號）取量mL0.510.522.濃縮膠的制備(2.5%)配4mL迅速混勻,取3mL沿壁連續(xù)平穩(wěn)加樣到分離膠上面,直至離邊緣5mm處,迅速插入加樣梳,室溫或37度烘箱靜置一段時間.※加樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.

凝聚后倒出上層的水,用小濾紙條吸去表面水分第23頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠凝聚后，垂直拔出加樣梳，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體。第24頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月(三).進樣將凝膠板放在電泳槽內，加入稀釋10倍的Tris－甘氨酸電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5cm,即可加樣．※要使凝膠凹形樣品槽內的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.

注意短玻璃板是向內側的。第25頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月取血清樣品0.1ml,40%蔗糖溶液0.2ml,0.05%溴酚藍溶液0.05ml混合后，用微量注射器取上述混合液，通過緩沖液，距凝膠凹形樣品槽底三分之一處進樣,待所有凹形樣品槽內都加了樣品，即可開始電泳。每個同學可做梯度上樣,

10μl．※注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,否則在樣品下沉時會發(fā)生擴散.第26頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月(四).電泳將電泳儀的正極負極與電泳槽連接（方向切勿接錯）將電泳緩沖液倒入電泳外槽，打開電泳儀開關，開始時將電壓調至150－200V，待樣品進入分離膠時，將電壓調至300V。當藍色染料遷移至距離橡膠下緣1cm時，關掉電源，停止電泳。第27頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳結束后，卸下膠框，用凝膠鏟小心撬開短玻璃板，在膠板一端切除一角作為標記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。※剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.

第28頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月(五).固定和染色將凝膠放入1%考馬斯亮藍G-250（內含6%乙酸）染色液中，使染色液沒過膠板，放到搖床上，染色5min左右。(六