診斷酶學自編第1頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述

通過本節學習，掌握的知識點1、酶的組成、結構及功能特點。2、酶的催化機制。3、什么是同工酶，LDH、CK等同工酶的分布及臨床意義。4、何謂工具酶，工具酶參與的指示反應。5、終點法和動力學法測定代謝物濃度的原理及區別。第2頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述一、酶的概念與特征（一）、酶的概念：

酶是活細胞分泌產生的具有催化活性的蛋白質或RNA。第3頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述（二）酶的組成及功能按照酶的分子組成：

單純酶：酶蛋白結合酶：金屬離子輔助因子

小分子有機化合物

第4頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述（三）、酶的催化作用機制1、酶的活性中心：

酶分子中能和底物特異性結合并將底物轉化為產物的區域稱為酶的活性中心。

第5頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述2、誘導契合學說在酶促反應中，酶與底物結合時，底物首先和酶分子上的活性中心相結合，形成酶-底物中間復合物（ES）。在構象上相互誘導，致使活性中心與底物完全緊密結合，這一過程稱為誘導契合學說。第6頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述（四）酶促反應動力學1、底物濃度對酶促反應速度的影響2、酶的濃度對酶促反應速度的影響3、溫度、PH、激活劑和抑制劑對酶促反應速度的影響。第7頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述二、同工酶的概念與特征1、概念

指催化相同的化學反應，但酶蛋白的分子結構、理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶。第8頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述二、同工酶的概念與特征2、特征（1）同工酶是由不同基因編碼的多肽，或由同一基因轉錄生成的不同的mRNA所翻譯的不同多肽鏈組成的蛋白質。（2）同工酶存在同一種屬或同一個體的不同組織或同一細胞的不同亞細胞結構中，它使不同組織、器官和不同的亞細胞結構具有不同的代謝特征。第9頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述二、同工酶的概念與特征3、臨床常用的同工酶第10頁，課件共99頁，創作于2023年2月第11頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述二、同工酶的概念與特征3、臨床常見的同工酶（1）LDH：

該酶是四聚體酶，由兩種亞基類型即骨骼肌型（M）和心肌型（H）。種類：LDH1，LDH2，LDH3,LDH4，LDH5。主要分布于心肌，紅細胞，骨骼肌和肝臟中。第12頁，課件共99頁，創作于2023年2月第13頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述二、同工酶的概念與特征3、臨床常見的同工酶（2）CK——肌酸激酶

該酶是二聚體酶，有兩種亞基類型即骨骼肌型（M）和腦型（B）。該酶有三種：CK1—腦中

CK2—心肌

CK3—骨骼肌

第14頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述二、同工酶的概念與特征3、人體重要的同工酶（2）CK——肌酸激酶

CK

肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP

血清中CK2的活性測定有助于心肌梗死的早期診斷。第15頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（一）定義：

酶學分析中作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱為工具酶。第16頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（二）工具酶參與的指示反應1、利用特異性較高的氧化酶產生過氧化氫，再通過加氧化發色劑進行比色的方法第17頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（二）工具酶參與的指示反應例：多胺氧化酶多胺氨基酸+H2O2+NH3+H2O2和4-AAP（氨基安替比林）顯色反應。第18頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（二）工具酶參與的指示反應2、NAD（P）H在340nm具有特征性光吸收，NAD（P）+在340nm處不具有特征性光吸收，利用氧化-還原酶反應使其連接到NAD（P）+/NAD（P）H正/逆反應中，通過該兩種物質量的變化間接反應待測酶的活性。第19頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（二）工具酶參與的指示反應例：己糖激酶法測定血清中葡萄糖濃度己糖激酶葡萄糖+ATP6-磷酸葡萄糖+ADP

6-磷酸葡萄糖脫氫酶

6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸

NADP+NADPH+H+

第20頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（三）酶循環法1、定義：采用兩類工具酶進行循環催化反應，使被測物放大擴增，從而提高檢測靈敏度。第21頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（三）酶循環法2、實例：酶循環法測定總膽汁酸第22頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（三）酶循環法2、實例：酶循環法測定總膽汁酸

解釋：硫代-NADH在405nm處有強值，膽汁酸的濃度與此處吸光值的變化成正比。△A/min（樣品）總膽汁酸濃度=△A/min（標準品）

第23頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（三）酶循環法3、優勢：（1）特異性好（2）反應溫和，無污染。（3）靈敏度高第24頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術

1、終點法（end-pointassay）

（1）定義：在代謝物酶促反應中，隨著時間的延長，待測物濃度逐漸減少而產物逐漸增多，一定時間后反應趨于平衡，測定反應達到平衡后待測物（底物）或產物的變化總量。第25頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術1、終點法（end-pointassay）（2）終點法測定的基本條件：①待測物濃度〔S〕應遠遠小于其米氏常數Km，此時任何時刻的反應速率

V=Vmax〔S〕/Km②反應配方中所用的酶量(V)應足夠大，而Km應小，以保證有較快的反應速度完成測定。第26頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術

1、終點法（end-pointassay）

（3）種類

直接法：待測物和產物在理化性質上有可直接進行檢測的差異，可以直接測定待測物或產物本身信號的改變來進行定量分析。第27頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術

1、終點法（end-pointassay）

（3）種類酶偶聯法：

如果酶促反應的底物或產物無可直接檢測的成分，則可將反應某一產物偶聯到另一個酶促反應中而達到的檢測目的。第28頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述酶偶聯法：

EXEiABCEx：為輔助酶Ei：為指示酶C：被檢測的物質第29頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述酶偶聯法（實際例子）：

血漿葡萄糖測定的氧化酶法（GOD）葡萄糖氧化酶葡萄糖+水+氧葡萄糖酸+H2O2

過氧化物酶

4-氨基安替比林+酚+H2O2紅色醌類化合物+水+氧

色原性氧受體第30頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術1、終點法（end-pointassay）（4）終點法實驗設計的考慮因素①工具酶的特異性高特異性②Km大小合適：在保證測定線性的前提下，Km值要盡量小。第31頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術1、終點法（end-pointassay）（4）終點法實驗設計的考慮因素③酶的用量：酶的用量足夠大，保證反應在較短的時間內完成。④工具酶中的雜酶應低于允許限制。⑤反應平衡點：保證反應朝正反應方向進行⑥附加劑：反應中添加的附加劑不抑制酶的活性，不影響試劑穩定性，不與底物或反應液中的物質發生作用。第32頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術2、動力學法（定時法）：

（1）定義：根據固定時間內底物消耗量和產物生成量計算酶的活性。（2）原理：當酶促反應為一級反應時，反應速度V=K〔S〕。此時測定酶促反應的初速度，根據標準濃度法即可求得待測物的濃度。

第33頁，課件共99頁，創作于2023年2月第一節概述三、工具酶（四）代謝物濃度的酶法測定技術2、動力學法（定時法）：（3）條件：實際操作中在底物濃度消耗小于5%時即可采用該方法。第34頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術通過本節的學習掌握如下知識：1、血清酶活性濃度測定技術有哪些？2、酶活性濃度定量系數K值的計算與實驗室的應用。3、臨床酶學測定的標準化要求和臨床意義。4、酶活性濃度單位？目前通用的酶單位的表示方法有哪些？5、酶質量免疫化學測定法的原理和優缺點6、同工酶分析方法及原理第35頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術

定時法酶活性測定連續監測法酶學測定方法酶質量測定：免疫酶法第36頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術一、酶活性測定（一）定時法測定酶活性（動力學法）1、定義

在足量底物系統中，加入一定量的酶試劑，反應一定時間后，加入終止試劑終止反應，然后測定該段時間內底物消耗量或產物的生成量計算酶的活性。第37頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術一、酶活性測定（一）定時法測定酶活性（動力學法）2、定時法計算酶活性假設某一樣品的酶活性為X（U/L），取樣品Vs（ml）與底物緩沖液Vr（ml）孵育，經反應后，加入終止液Ve（ml），檢測到產物凈吸光度增加為A，該產物的摩爾消光系數ε，比色杯光徑為b（cm）。第38頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術一、酶活性測定（一）定時法測定酶活性（動力學法）2、定時法計算酶活性第39頁，課件共99頁，創作于2023年2月定時法中可能引起的誤差3、消除誤差方法：做預實驗找出酶促反應速率恒定的時期，確定線性時間，然后在該段時間內測定。第40頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（二）、連續監測法測定酶活性（終點法）

1、定義：

連續監測法是將酶和底物在特定的條件下孵育，每隔一定時間（2-60s）連續測定酶促反應過程中某一底物或產物的特征信號的變化，從而計算出每分鐘的信號變化速率。第41頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術第42頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術3、分類（1）、直接法

直接通過測定反應體系中底物或產物理化特性的變化，從而計算出酶活性濃度。第43頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（2）、間接法——酶偶聯反應

ExEiABCExEaEiABCD

Ex：待測酶Ea：輔助酶Ei：指示酶第44頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術采用酶偶聯法測定酶活性前提：延滯期越短越好第45頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術采用酶偶聯法測定酶活性前提：指示酶量的選擇標準①Vx/（Km）x=Vi/（Km）iVx：測定酶的測定上限（Km）x\（Km）i是測定酶和指示酶的Km值。第46頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術采用酶偶聯法測定酶活性前提：指示酶量的選擇標準②米-曼氏方程

Vx=

Vi=Vx[1+]Vi×PP+（Km）i（Km）iP第47頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術采用酶偶聯法測定酶活性前提：指示酶量的選擇標準③第48頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（三）干擾因素1、其他酶和物質的干擾2、酶的污染3、非酶反應4、分析容器的污染5、沉淀形成第49頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（四）血清酶活性濃度測定條件的優化1、方法的選擇2、儀器和設備3、試劑4、自動生化分析儀參數的設置第50頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（五）分析前因素對酶活性測定的干擾1、溶血2、抗凝劑3、標本的儲存溫度第51頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（六）酶活性濃度的單位1、酶活性單位（1）慣用單位（2）國際單位

定義：在特定的條件下，一分鐘內使底物轉變1μmol的酶量為一個國際單位，以IU表示。1IU=1μmol/min第52頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（六）酶活性濃度的單位（3）Katal單位：

定義：在規定條件下，每秒內催化轉化

1mol底物的酶量。1Katal=1mol/s

Katal是我國法定的酶活性單位，常用單位一般為μKatal或nKatal。

1Katal=60×106UIU=1μmol/min=16.67nmol/s=16.67nKatal第53頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（六）酶活性濃度的單位2、酶活性濃度單位（臨床上，酶活性濃度以每單位體積所含的酶活性單位數表示）（1）表示方法：目前我國各級臨床中表示酶濃度的方法是U/L。

1U/L=16.67nKatal/L

第54頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（六）酶活性濃度的單位2、酶活性濃度單位的計算

U/L=×

△AV×106minε×V×L說明：V：反應體系體積（ml）

ε：摩爾吸光系數（cm2/mol）

v：樣品量（ml）L：比色杯光徑（cm)

△A：吸光度變化106：將mol換算成μmol摩爾吸光系數的定義為：在特定的條件下，一定波長的光，光徑為1.00cm時，通過所含吸光物質的濃度為1.00mol/L的吸光度第55頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（六）酶活性濃度的單位3、參考區間和正常上限的倍數應用（1）參考區間第56頁，課件共99頁，創作于2023年2月第57頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（六）酶活性濃度的單位3、參考區間和正常上限的倍數應用（2）正常上限倍數的應用正常上限（upperlimitsofnormal,ULN）第58頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（七）系數K值的計算與應用1、K：酶活性濃度定量系數，主要用于臨床酶活性測定的計算與校準。

U/L=×KK=例：NADH的ε為6.22×103cm/mol，血清量50μm，底物溶液為1ml。比色杯光徑為1cm，則K=1.05×106/（6.22×103×0.05×1）=3376△AminV×106ε×V×L第59頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（七）系數K值的計算與應用2、K的意義與設置

K的設置應該考慮測定酶的參考范圍上限及測定的時間兩個方面。過高：測定的線性范圍寬，但是重復性差

過低：線性范圍窄，但是精密度好第60頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（八）臨床酶學測定的標準化1、標準化途徑（1）使用推薦方法和參考方法（2）使用公認的酶校準物或酶參考物第61頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術（八）臨床酶學測定的標準化2、酶活性濃度測定的參考系統（1）建立原級參考方法（2）制備原級參考物（3）建立參考實驗室網絡第62頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術二、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理1、放射免疫測定（RIA）將放射性核素標記的酶分子與相應的抗體作用產生沉淀，再將沉淀分離進行定量測定。例：用RIA檢測尿中五項蛋白：β2-MG、IgG、Alb、THP、α1-MG診斷早起腎病。第63頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術二、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理2、其它方法：

（1）免疫抑制法常用于同工酶的測定。例如：CK-M抗體檢測CK-MB的活性。第64頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術二、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理2、其它方法：（2）化學發光免疫測定（CLIA）將高靈敏度的化學發光測定技術與免疫法相結合的一項技術。第65頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術二、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理2、其它方法：（3）酶免疫測定（EIA）將酶催化作用的高效性與抗原抗體反應的特異性結合的一種微量分析技術。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）酶免疫組化技術第66頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術二、酶質量測定（一）免疫化學法測定酶質量的原理2、其它方法：（4）熒光免疫測定（FEIA）是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤技術相結合的測定方法。標記物：熒光素第67頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術二、酶質量測定（二）酶質量免疫化學測定法的優點1、靈敏度高2、特異性高3、能用于測定一些無活性的酶蛋白4、應用于同工酶的測定第68頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術二、酶質量測定（三）免疫化學測定法的局限性1、制備足夠量的提純酶做為抗原或制備具有免疫化學性質的抗血清比較困難。2、測定繁瑣3、測定成本高第69頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術三、同工酶的檢測第70頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術三、同工酶的檢測（一）電泳法1、常用方法：醋酸纖維薄膜電泳（CAE）、瓊脂糖凝膠電泳（AGE），聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）等。第71頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術三、同工酶的檢測2、例：LD瓊脂糖電泳（1）電泳（2）染色（3）洗脫背景色（4）掃描區帶（或將區帶切下比色測定）電泳結果是從正極向負極順序：LD1，LD2，LD3，LD4，LD5第72頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術三、同工酶的檢測第73頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術三、同工酶的檢測3、巨分子酶對電泳分析同工酶的影響（1）酶與免疫球蛋白形成復合物（2）酶與其它蛋白形成復合物（3）酶亞基與酶分子之間形成的聚合物第74頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術第75頁，課件共99頁，創作于2023年2月第二節酶測定技術三、同工酶的檢測（二）層析法（三）免疫分析法（四）同工酶的其它分析方法第76頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用

一、血清酶（一）、血清酶的來源與去路1、血清酶的種類分類依據：酶的來源以及在血漿中發揮催化功能的情況。（1）血漿特異酶：在血漿中發揮特定的催化作用的酶（血漿固有酶）來源：肝臟第77頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用（一）、血清酶的來源與去路1、血清酶的種類分類依據：酶的來源以及在血漿中發揮催化功能的情況。（2）非血漿特異性酶：在血漿中很少發揮作用。外分泌酶：來源于消化腺或其它外分泌腺的酶。細胞酶：存在于各組織細胞中進行代謝的酶類。第78頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用（一）、血清酶的來源與去路2、血清酶的去路

血清酶的半衰期是指酶失活至原來活性一半時所需要的時間。一般以半衰期代表酶從血液中清除的快慢。第79頁，課件共99頁，創作于2023年2月第80頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用（二）血清酶的生理差異1、性別

CK，ALP及γ-GT等有性別差異，男性略高于女性。2、年齡新生兒略高于成人實例：ALP1~5歲增至成人的2~3倍

10~15歲可達成人的3~5倍

20歲降至成人水平第81頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用（二）血清酶的生理差異3、進食在高脂、高糖飲食后血清中ALP活性增高。酗酒可使血清γ-GT升高第82頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用（二）血清酶的生理差異4、運動激烈的肌肉運動可使血清中多種酶如CK、

LD、AST、ALD和ALT等活性升高，其升高的幅度與運動量、運動時間、運動頻率及骨骼肌所含的酶量有關。第83頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用（二）血清酶的生理差異5、妊娠妊娠期，胎盤組織可分泌一些酶進入母體血液，比如：ALP,LD,LAP,ALT等，引起血清中這些酶升高。6、其它血清中有些酶有種族差異。

第84頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用（三）血清酶的臨床應用第85頁，課件共99頁，創作于2023年2月第86頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用二、尿液酶目前了解較多的尿液酶：AMS、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）白細胞酯酶

溶菌酶（LZM）、丙氨酸氨基肽酶（APP）β-葡萄糖苷酸酶（GRS）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）

LD、ALP、γ-GT

第87頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用1、AMS-尿液淀粉酶（1）來源：唾液腺或胰腺（2）種類：S型（唾液腺型）和P型（胰腺型）（3）用途：急性胰腺炎和急性腮腺炎（4）干擾因素

a、診斷胰腺炎的時候，應排除腎病和巨淀粉酶血癥.b、尿液淀粉酶的活性影響因素：酸尿、草酸鹽、檸檬酸鹽可抑制該酶活性；磺胺類藥物、止痛藥可使該酶活性增高。

c、急性闌尾炎、腸梗阻、胰腺癌等可使AMS升高。

第88頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用二、尿液酶（二）NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶1、來源：腎近曲小管上皮細胞2、用途（1）各種腎實質早期損傷的敏感標志物（2）糖尿病性腎病早期發現和病程監測的重要項目（3）反映腎病綜合癥、腎小球腎炎、高血壓腎病和視網膜病的發展。（4）用于藥物治療時毒性反應，腎重金屬毒害、腎移植排異監測等。第89頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用三、漿膜腔積液酶漿膜腔：人體的胸腔、腹腔和心包腔、關節腔的統稱。漿膜腔積液：病理狀態下漿膜腔內大量的液體潴留。第90頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用三、漿膜腔積液酶（一）腹水：腹腔內的過多積液1、腹水中的主要酶：LD和ADA等2、臨床意義（1）結核性滲出液：ADA升高（2）惡性腹水：ADA偏低（3）胰腺炎或胰腺創傷：AMS增高

第91頁，課件共99頁，創作于2023年2月第三節常用酶及同工酶測定的臨床應用三、漿膜腔積液酶（二）胸腔積液1、分類（1）漏出液：代償性心力衰竭（2）滲出液：肺炎、惡性腫瘤或肺栓塞2、臨床意義：（1）LD﹤200U/L為漏出液,LD﹥200U