2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity第三章細胞生物學的研究方法王紅勝,講師中山大學藥學院,212室Tel:E-mail:本章內容顯微鏡技術細胞的分離和培養細胞組分的分離和純化技術(自學）細胞化學和細胞內分子示蹤技術(自學）細胞功能基因組學研究技術(自學）生物大分子結構測定(自學）第一節、顯微鏡技術2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity細胞的大小和計量單位鴕鳥卵=12-15cm人卵細胞=0.1mm多數細胞=10-30μm血細胞=7μm

顯微鏡觀察范圍肉眼觀察范圍

（一）普通光學顯微鏡技術(lightmicroscopy,LM)1.構成：①照明系統②光學放大系統③機械裝置2.原理：經物鏡形成倒立實像，經目鏡放大成虛像一、分辨率可達0.2μm的光學顯微鏡技術2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity1.分辨率(resolusion)：區分兩個質點間的最小距離。其中:N=標本和物鏡之間介質折射率;λ=入射光線波長；

α=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）nsinα/2稱為物鏡的數值孔徑(numericalaperature,NA)R=0.61λ/NA思考題：如何提高顯微鏡的分辨能力？0.61λ分辨率DN.sinα/2=顯微鏡的幾個光學特點：制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介質為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長為400~700nm，分辨力數值不會小于0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大設計倍數為1000X。3.組織切片的制備固定(fixation)：使大分子交聯而保持在原有的位置上，防止移位或信息丟失。常用的固定劑：戊二醛、甲醛包埋(embedding):

使組織形成硬塊，便于切片。常用的包埋劑：石蠟、樹脂切片(section)：切片厚度：1~10μm染色(staining)：增大反差。2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity正置光學顯微鏡倒置顯微鏡光路系統（二）熒光顯微鏡技術1.熒光和熒光染料熒光：熒光分子可在吸收特定波長的光后，發射出更長波長的可見光，稱為熒光。前者稱激發光(excitationlight)，后者稱發射光(emmissionlight)。熒光染料：由于熒光分子可以使被檢樣品呈現不同的顏色，因此也稱熒光染料。細胞內某些天然物質，如葉綠素就是熒光分子一些細胞成分雖不是熒光分子，但可用熒光分子對其進行染色或標記，應用廣：吖啶橙能對DNA和RNA同時染色，顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色，RNA呈紅色與抗體共價結合的熒光分子，可用來特異性檢測細胞表面或細胞內特定的抗原熒光染料2.熒光顯微鏡的工作原理結構特點：光源：高壓汞燈和弧光兩組濾光片(右圖)1.第一個濾光片：僅讓波長在450~490nm的藍光通過；2.分光鏡：510nm以下的光反射，510nm以上的光通過；3.第二個濾光片：阻斷不需要的熒光信號，使波長在520~560nm特異的綠色熒光通過。光源熒光顯微鏡在光鏡水平用于特異蛋白質等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應用Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）相差顯微鏡技術把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處：環形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。與普通顯微鏡的差別在于：用環形光闌替代可變光闌，用帶相位板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個合軸用的望遠鏡。直接觀測活細胞活細胞內各種結構呈現清晰可見的明暗對比，如觀測培養的細胞的倒置相差顯微鏡。（四）暗視野顯微鏡技術

darkfieldmicroscope原理：通過散射光成像聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的。可觀察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。適合觀察活細胞內的細胞核、線粒體，液體介質中的細菌、真菌等觀察物體輪廓（五）顯微電影攝影技術計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下記錄活細胞中的顆粒及細胞器的運動過程。

（六）激光共聚焦掃描顯微鏡技術

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM

排除焦平面以外光的干擾，只有從標本焦面發出的光線聚焦成像。增強圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構樣品的三維結構。原理：用單色激光作光源；共聚焦：物鏡和激光鏡相互共焦點，只有從標本焦面發出的光線可以聚焦成像，而焦面以外的漫射光不參加成像；逐點、逐行、逐面快速掃描。能顯示細胞樣品的立體結構。分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)激光共聚焦掃描顯微鏡光源：電子束：10萬伏特電壓加速);波長短：0.004nm。分辨率：理論值：0.002nm實際值：0.1nm。金屬材料可達0.2nm生物樣品：2nm(樣本制備、反差、照相損傷)電子顯微鏡下觀察到的結構——超微結構

二、電子顯微鏡技術2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity

分辨率

D=0.61λ/N.Sin(/2)N=1,Sin180/2=1

λ越小分辨率越高

人們尋找更短波長的照明物質以提高分辨率

光學顯微鏡的分辨率在理論上不能小于0.2nm,這是因為受光波波長的局限,即可見光的波長不能小400nm。

電鏡是利用電子束對樣品放大成像的顯微鏡，電子束波長為0.01-0.9nm，因而分辨率大大提高。

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電鏡與光鏡的比較2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity電鏡的類型透射電鏡TEM（TransmissionElectronMicroscope）：內部結構觀察掃描電鏡SEM（ScanningElectronMicroscope）：外部形態觀察掃描透射電鏡STEM（ScanningTransmissionElectronMicroscope）外部形態及內部結構觀察超高壓透射電鏡（Ultra-voltageTransmissionElectronMicroscope）：活體觀察(一）透射電子顯微鏡

transmissionelectronmicroscope,TEM

原理以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統、電磁透鏡成像系統、真空系統、記錄系統、電源系統等5部分構成。分辨力0.2nm，放大倍數可達百萬倍。用于觀察超微結構（小于0.2μm）。2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity不同光線的波長電鏡與光鏡光路圖比較2、制樣技術雙重固定：通常以鋨酸(脂類)和戊二醛(蛋白)固定樣品；脫水：丙酮逐級脫水，含水標本干擾觀察；包埋：環氧樹脂包埋；切片：超薄切片，僅50nm，用超薄切片機（ultramicrotome）制作，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片；染色：重金屬（鈾、鉛）鹽染色。2010-112023/7/14WanghsSunYat-senUniversity2.負染色(negativeStaining)和投影(shadowcasting)技術

2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity(1)負染色:使整個載網都鋪上一層重金屬鹽,而凸出的樣品則沒有染料.(2)投影技術:又叫噴鍍技術,增強背景和待觀察樣品反差.2010-11中山大學藥學院鐘翎39透射電鏡借助金屬投影、冰凍斷裂和冰凍蝕刻技術獲取三維圖像金屬投影法(metalshadowing)原理：以一定的傾斜角度向樣品表面噴射重金屬，顯示投影效果，給出樣品表面三維結構。

應用：觀察核酸、蛋白質大分子，病毒顆粒及細胞壁。NegativeStainedArchaebacteria冰凍斷裂freeze-fracture樣品制備：標本快速冷凍→冰刀從脂雙層疏水部分撬開→暴露膜內部構造斷面結構。應用：觀察細胞膜性結構的內部構造冰凍蝕刻(freeze-etch)樣品制備：冰凍組織→冰刀撬組織→真空升華→暴露膜結構應用：觀察細胞的內部結構斷面的三種處理方法：蝕刻（etching）、不蝕刻（noetching）、深度蝕刻（deepetching）培養細胞內面的深度蝕刻電鏡照片，示網格蛋白(Clathrin)衣被

（二）掃描電子顯微鏡

Scanningelectronmicroscope（SEM）20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結構。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力（區別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。觀察標本表面分辯率3－10nm，用于細胞整體或組織的觀察。電子“探針”掃描，激發樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。Scanningelectronmicroscope（SEM）是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。工作原理SEMLightPathway2010-11中山大學藥學院鐘翎49人類紅細胞三、納米顯微技術納米尺度：1~100nm生命是納米尺度的分子活動，細胞是納米組裝機的集合體掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡的分辨率和可操控的顆粒再納米水平，被稱為納米顯微技術1.掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscaope,STM)原理：使用原子尺度的探針，在標本的表面進行掃描，在探針針尖和樣品間施加一定電壓，產生隨標本表面形貌變化的隧道電流特點：分辨率高，可在大氣和液態等非真空狀態下工作應用：直接觀察大分子的三維結構，如DNA雙螺旋結構2.原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)原理：通過分析探針針尖與樣品間原子間作用力，來獲取觀察表面的微觀信息特點：可以在固態，液態和氣態下工作應用：活細胞表面和生物大分子空間伸展及其晶體表面觀測，進行單個分子操作。2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity結腸癌細胞HCT-116的接觸式AFM形貌圖未加入TNFα20ng/mLTNFα第二節、細胞的分離與培養2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity離心(差速，密度梯度)流式細胞術免疫磁珠法激光捕獲顯微切割技術一、分離不同類型細胞(一)離心技術是分離細胞器及各種大分子基本手段。轉速為10~25kr/min的離心機稱為高速離心機。轉速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機。超速離心機的最高轉速可達100000r/min，離心力超過500Kg。從組織中分離細胞的第一步：將組織制備成游離的細胞懸液胰蛋白酶，膠原酶

EDTA消除細胞間的連接和細胞外基質1.差速離心Differentialcentrifugation特點：介質密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。沉降順序：核→線粒體→溶酶體與過氧化物酶體→內質網與高基體→核蛋白體。可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。2010-11中山大學藥學院鐘翎58LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation2.密度梯度離心用介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過離心力場的作用使細胞和細胞成分分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細胞的介質要求：1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）pH中性或易調為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細胞無毒。(二)流式細胞術用途：流式細胞儀(flowcytometer)：從多細胞懸液中分離目的細胞的精密儀器對單個細胞進行快速定量分析與分選

的一門技術。原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統計結果，并可根據這些性質分選出高純度的細胞亞群;樣品處理：用帶有熒光的抗體標記待分離的細胞；分離速度：2萬個細胞/s；分離純度：>95%。(三)免疫磁珠法原理：帶有特定抗體的免疫磁珠(immunomagneticmicrosphere)與靶細胞的特異結合，快速地從多細胞懸液中將目的細胞分離出來。分離純度：95~99%(四)激光捕獲顯微切割技術(LaserCaptureMicrodissection,LCM)原理：在載玻片上制作冰凍或石蠟切片并染色，在顯微鏡下將切片覆以特制的透明薄膜，用能量較低的紅外激光切割所需要的組織細胞，甚至單個細胞，覆膜在激光束經過的地方被融化，并與下面的細胞結合，再用另一束激光束將其彈出到細胞收集管。應用：可用于生化與基因組分析研究；該方法將形態學觀察與分子水平研究結合起來，特別適用于數量少或散在分布的細胞的分類研究二、細胞培養細胞培養(cellculture)：從機體中取出組織或細胞，模擬體內的生理環境，使之能夠繼續生存、生長和增殖的方法1.條件

(1)營養條件：培養基：RPMI-1640，DMEM血清

(2)5%CO2(3)無菌環境培養瓶培養板細胞培養的基本設備原代培養(primaryculture)：直接取材于有機體組織的培養；傳代培養(secondaryculture)：原代培養的細胞，再經1：2以上的比例的擴大培養。傳代培養的細胞常表現出其來源組織的分化特性Hela細胞CHO細胞2.原代和傳代培養3.細胞系細胞系(cellline)：在培養的細胞中產生不死的變異細胞，這種細胞可以無限地繁殖、傳代來源：包括培養過程中發生轉化的正常細胞和取材于腫瘤組織的原代培養細胞；細胞株(cellstrain)：用細胞克隆化的方法進一步改善細胞的均一性，即分離出單個細胞使其增殖形成的細胞群細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞HenriettaLacksBHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠實驗室中常用的幾種細胞系4.細胞融合細胞融合(cellfusion)：在自然或人工條件下，使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程；誘導方法：生物法：滅火的仙臺病毒化學法：聚乙二醇PEG物理法：電融法細胞融合時首先形成雙核或多核的異核體(heterokaryon)，通過有絲分裂，形成雜交細胞

(hybridcell);應用：單克隆抗體制備5.胚胎干細胞干細胞(embryonicstemcell,ES細胞)：具有自我更新和分化潛能的未成熟的細胞。培養條件：常用培養基飼養細胞層：阻斷有絲分裂后的單層成纖維細胞。分泌各種因子促ES細胞增殖、抑制ES細胞分化。條件培養基生長特點：克隆狀生長，細胞界限不清細胞鑒定：細胞形態特征不明顯。標志酶(堿性磷酸酶)、抗原或分化能力干細胞的類型干細胞來源分化潛能全能干細胞totipotent多能干細胞Multipotent/pluripotent專能干細胞胚胎干細胞embryonicstemcell成體干細胞adultstemcell2010-11中山大學藥學院鐘翎74第三節、細胞組分的分離和純化技術2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity

原理：利用顆粒大小的不同:差速離心法速度區帶離心法利用顆粒密度的不同:等密度離心法一、細胞組分的分級分離1、差速離心法：用于分離大小、形狀不同顯著的組分，根據顆粒沉降速度不同得以分離2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity2、速度沉降分離沉降系數不同的顆粒：用于分離大小差別不顯著的組分2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity3平衡沉降分離密度不同的顆粒：根據被分離物質的浮力密度差別進行分離，所用的介質起始密度約等于被分離物質的密度，介質在離心過程中形成密度梯度，被分離物質沉降或上浮到達與之密度相等的介質區域中停留并形成區帶。2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity二、層析1、紙層析二、層析2、柱層析2、柱層析常用方法：離子交換層析凝膠過濾層析親和層析三、蛋白質電泳1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）電泳（electrophoresis）:在含有蛋白質分子的溶液里加上電場，蛋白質就會按照它的凈電荷、大小和形狀，以一定的速度在電場中移動，這一技術叫電泳。2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity三、蛋白質電泳2、

雙向電泳目的：單向SDS－PAGE電泳分辨力差，只能分開50左右種的蛋白。雙向電泳可分辨1000種以上的蛋白質，一般為2000～15000種。2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity以下材料課后自學基因研究的各種方法王紅勝,講師中山大學藥學院,212室Tel:E-mail:Northernblotting

關鍵點：DNA探針，

標記試劑盒（同位素和

非同位素）；設內標；

優點：特異性和敏感性高

缺點：實驗繁瑣，同位素

基因水平的檢測同位素標記細胞中的受體基因表達水平RT-PCR：（reversetranscription-polymerase

chainreaction)

RT-PCR主要由兩大步驟組成，一是反轉錄（RT），二是PCR。它與普通PCR的區別就在于它是以mRNA為最初始的模板。RT-PCR的用途很廣泛，既可以用來構建cDNA文庫，也可以獲得感興趣的基因的cDNA序列。如果以內源的一些參照為標準，還可以用于研究細胞內特定基因的mRNA的表達水平。關鍵點：mRNA，相關引物，

PCR儀不足：只能相對定量，不能絕對定量Real-timePCR

實時定量PCR技術是近年來發展起來的一種新的基因定量檢測技術，它通過PCR擴增中Tag酶的5’－3’的核酸外切酶活性，可以將標記在探針上的熒光基團一淬滅基團分離，使熒光基團脫離淬滅基團的控制，從而產生熒光發射。通過熒光吸收裝置檢測發出熒光的多少來反映模板量的高低，從而達到實時定量的目的。關鍵點：引物設計，real-timePCR儀倍數差2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity原位雜交定位基因的表達1，組織/細胞固定脫水石蠟包埋切片2，DNA探針的制備（地高辛或同位素標記）3，探針標記mRNA顯示mRNA4，顯微鏡觀察關鍵點：相應的DNA探針；地高辛試劑盒或同位素，切片機；對照組的設置對照組實驗組KAI1RNA干擾技術發現者獲得諾貝爾獎；RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是一種可以在細胞內抑制特定基因表達的現象。它由雙鏈RNA產生，可以特異性地降解具有相同或者相似序列的RNA（包括mRNA）。它是一種比反義技術更為有效的方法，具有更高的特異性。關鍵點：確定19－21寡核苷酸（一條基因上有許多條候選寡核苷酸），cDNA轉錄成mRNA的試劑盒（效果好但價格貴），或表達載體p-Super,轉染試劑盒；要設置好對照（不相關的序列）不足：干擾不夠穩定、不完全，不能長時間作用熒光酶基因（Luc）是從螢火蟲cDNA文庫中克隆的哺乳動物細胞和組織沒有任何內源性熒光素酶活力，所以Luc可作為非常靈敏的遺傳報告基因熒光酶報告基因具有檢測速度快、靈敏度高、費用低、用途廣、可定量等優點基因轉錄活性的檢測

（熒光素酶檢測方法）基因轉錄活性的檢測

（熒光素酶檢測方法）關鍵點：Luciferase-報告基因，表達載體，-gal,轉染效率，熒光檢測儀基因芯片分析設置好對照組，取樣（mRNA）由公司測定，提供基因檢測結果（根據細胞功能分類）排除變化相同的基因確定變化差異的基因選擇感興趣的基因進一步證實它們的變化該方法特別適合用于信號通路中新的下游靶基因的發現蛋白研究的各種方法

Westernblotting

關鍵點：相應的抗體；ECL顯示試劑；設內標；

不同抗體差別很大：用量、效果、特異性

使用的電泳膠的濃度與蛋白的分子量密切相關

（反比關系）

優點：可用于定量分析蛋白表達水平的檢測蛋白半衰期CHX(cycloheximide)放線菌酮有的蛋白在細胞內的半衰期很短CHX的作用是抑制新蛋白的合成2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity免疫組織化學方法顯示蛋白1，組織/細胞固定脫水石蠟包埋切片2，免疫組化染色3，顯微鏡觀察關鍵點：相應的抗體；切片機；對照組的設置對照組實驗組蛋白的相互作用和

蛋白與DNA的結合分析免疫沉淀/免疫印跡(Co-IP)

Immunoprecipitation/Westernblot用特異性抗體結合細胞裂解液中的某個目的蛋白質（即免疫沉淀），洗滌后解離特異性抗體和目的蛋白質，經聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），最后用Westernblot分析顯示另一個目的蛋白質。這種方法可以分析溶液中、細胞內的相互作用蛋白，但只能是定性或半定量的實驗。BIAcore生物分子相互作用分析（BiomolecularInteractionAnalysis）

基于表面等離子體共振（SPR）來實時跟蹤生物分子間的相互作用的技術。被廣泛應用于各類生物體系的測定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細胞。具有高天然性、高效率、高靈敏度、樣品量少、應用廣泛等優點，但儀器昂貴、不易操作、價格高。凝膠阻抑實驗

（Gelretardationassay）

當DNA結合蛋白與相應的DNA片段或寡核苷酸結合而形成DNA-蛋白質復合物后，使DNA片段的分子量及電荷發生改變，因而在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中其電泳遷移率發生改變，通常較游離的DNA片段的泳動速率慢得多，在X光膠片上形成一較游離DNA片段滯后的帶型。

實驗過程：DNA片段(probe)進行末端標記（同位素、生物素或熒光）probe與核蛋白孵育電泳干膠曝光染色質免疫共沉淀

（ChIP）利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測體內蛋白與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。ChIP與其他方法的結合，擴大了其應用范圍：

CHIP與基因芯片相結合建立的ChIP-on-chip

方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；ChIP與體內足跡法相結合，用于尋找反式因子的體內結合位點；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表達調控中的作用。DNAaffinitypurificationassay（DAPA）合成擬分析的DNA片段，在DNA片段的末端接上biotin作為探針與核蛋白孵育，再與能耦合生物素的瓊脂糖珠子免疫沉淀，最后利用westernblot的方式分析，從而獲得與DNA探針相互作用的蛋白質信息。蛋白標記和定位熒光顯微鏡技術不同熒光素的激發光波長范圍是不同的，所以同一樣品可以同時用兩種以上的熒光素標記。標記熒光素的樣品在熒光顯微鏡下經過不同波長的激發光激發，可以發射出不同顏色的熒光。熒光顯微鏡中只有激發熒光可以成象，因為產生激發光的光全被樣品與照相機之間的濾光片吸收。關鍵點：相應的抗體；熒光染料；熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡技術

采用激光做光源,激光束經照明針孔,由分光鏡反射至物鏡并聚焦于樣品上,對標本內焦平面上的每一點進行掃描,然后,激發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡,通過探測針孔時先聚焦,聚焦后的光被光電倍增管探測收集,并將信號輸送到計算機,在顯示屏上顯示圖像。優點：分辨率高，可以實時跟蹤觀察光漂白后熒光恢復(FRAP)光漂白后熒光恢復:就是在光漂白后對樣本確定區中的熒光恢復。FRAP是由沒有漂白的熒光團從周圍進入漂白區的運動引起的。FRAP用于測量2-維或3-維分子運動的力度。分子運動包括膜或活細胞內用熒光標明的分子的擴散、轉移或其他類型的運動。光漂白中的熒光損失(FLIP)光漂白中的熒光損失：是一個鄰近重復漂白區的被定義區域內熒光的減少或消失。與FRAP一樣，FLIP被用來測量膜或活細胞內分子運動的力度。細胞異體融合通過誘導融合劑可以誘導細胞融合。目前比較有效的融合劑是高pH，高Ca，和聚乙二醇PEG。最常用的兩種細胞融合：NIH3T3,HeLa研究過程需要用CHX，以抑制新的蛋白合成小鼠成纖維細胞:NIH3T3人宮頸癌細胞:HeLa相差顯微鏡技術相差顯微鏡和普通光學顯微鏡最主要的不同點是在物鏡后面安裝一塊“相差板”，偏轉的光線分別通過相差板的不同區域，由于相差板上部分區域有吸光物質，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起了放大的作用。最后，這兩組光線經過透鏡又會聚成一束，發生互相疊加或抵消的干涉現象，從而表現出肉眼明顯可見的明暗區別。最大優點：樣品無需染色，可以觀察活細胞流式細胞技術的應用

細胞分選

周期、凋亡測定

細胞表面蛋白定量

DNA滲入量測定

線粒體膜電位測定

流式細胞術定量分析

細胞凋亡率和細胞周期DAPI染色細胞流式細胞儀分析可用于分選細胞流式細胞術直接定量分析

細胞存活率PI（碘化丙啶）染色細胞，不能透過活細胞膜，但可以結合到死細胞的DNA碎片上。所以細胞表現出不同的熒光值。流式細胞術定量蛋白表達量限制：僅用于膜蛋白含量的檢測。關鍵點：抗體，相應的熒光素標記的二抗；流式細胞儀。蛋白表達量以面積表示。流式細胞術檢測細胞中

DNA合成量(BrdU法)JC－1是一種碳氰化合物類陽離子熒光染料，具有電勢依賴性積聚于線粒體內膜的特性。它在線粒體上以單體和聚合體兩種不同的物理形式存在。JC－1特異地與線粒體內膜結合，只在線粒體膜電位崩解的時候才釋放出來，因此，檢驗結果可靠，敏感性高。熒光探針JC-1檢測線粒體膜電位蛋白結構的分析利用Edman降解法直接測定蛋白質分子中的肽段序列，并拼接出蛋白質分子的全序列。根據蛋白質的cDNA序列的測定，推斷出蛋白質分子的序列。質譜分析：通過酶解產生肽段片段，通過質譜儀分析肽指紋圖譜，從而獲得氨基酸序列，再與網上蛋白庫匹配，來確定是已知還是未知蛋白。

蛋白質一級結構測定方法生物質譜檢測制備技術2D膠電泳－切膠－脫色－脫水－還原－烷基化－洗膠－脫水－泡漲－脫水－重泡漲－酶切－萃取－干燥－質譜分析主要國際互聯網上的免費蛋白數據庫檢索程序，網址如下:

MascotMS-Fit:htmlucsf3.0/msfit.htmPeptident:peptidennt.htmlPeptideSearch:

Services/PeptideSearch

數據庫檢索網址

蛋白質空間結構測定方法

X射線衍射方法測定蛋白質分子的晶體結構。二維核磁共振技術測定蛋白質分子在溶液中的結構。用于測定蛋白質空間結構相對變化和變化速度的方法有：熒光滴定技術，紫外差吸收，園二色光譜，紅外光譜，Raman光譜，脲梯度電泳，各種反應基團的暴露。核磁共振儀分析蛋白質的二級結構

核磁共振圖譜2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity計算方程：

lg(Fo/F-1)=lgKA+nlg[Q]；其中：

Fo，F分別為蛋白質與藥物作用前后的熒光強度；

[Q]為藥物濃度；KA為結合常數。以lg(Fo/F-1)對lg[Q]作圖，可求得藥物與蛋白分子的結合常數和結合位點數。熒光滴定方法分析小分子化合物

與蛋白的結合關鍵點：熒光分光光度計純化蛋白（能夠自發熒光，脯氨酸、色氨酸基團）蛋白質相互作用儀Cell,virus,bacteria,protein,DNAandsmallmolecular;antibody-antigen,receptor-ligand,DNA-DNA,DNA-protein,protein-smallmolecularetc.

全自動，高通量，實時檢測，快速分析生物分子之間的相互作用;相互作用分析包括：分子結合定量分析,動力學和親和性分析，結合能力和協同性分析（結合速率Ka，解離速率Kd，結合常數KD）不用對樣品作任何標記和修飾

圓二色譜分析蛋白構象改變

旋光值計算：分子對接模擬預測化合物與蛋白結合的模型Kd=1.68MKd:ND分析超離方法檢測化合物與蛋白的相互作用原子力顯微鏡(AFM)優點：1)原子力顯微鏡作為掃描探針顯微鏡的一種，可觀察生物形態結構。2）利用AFM,可使得細胞及生物大分子在生理溶液的條件下成像。AFM對于生物系統的成像分析比光學顯微鏡具有更高的分辨率（大約可以到1nm），比電鏡觀察所需要的樣品處理更接近于生理條件，并且比光譜學技術（通常需要從大量光譜信號中間接推導出結構信息）更直觀。而相對于晶體學方法來說，AFM分析不需要依靠于晶體樣品，這非常有利于研究天然狀態下的生物樣品。蛋白修飾泛素化(ubiquitination)類泛素化(sumoylation)甲基化(methylation)乙酰化(acetylation)磷酸化(phosphorylation)……………研究的必要性和重要性

蛋白質是基因功能的實施者，蛋白質的定位、翻譯后修飾及蛋白質-蛋白質相互作用決定了蛋白質的功能，也為研究細胞生長，分化和凋亡及重大疾病發生和發展提供了基礎。蛋白質的功能與其空間定位有著密切的相關，且通過在不同亞細胞環境里的轉位而發揮作用。蛋白質的翻譯后修飾對蛋白質發揮正常功能具有重要作用，經過特殊修飾的蛋白質通常可定位在特定的位置，與特異的蛋白質相互作用，行使特殊的功能。蛋白質通過動態相互作用，形成大的復合體，在特定的時間和空間中完成特定的功能，這其中也發生特定的蛋白質修飾。因此，只有系統研究蛋白質的定位、翻譯后修飾及蛋白質-蛋白質動態相互作用的規律，才能從真正意義上闡明一個蛋白質的功能，才有可能研究細胞中某一生理活動中相關功能蛋白質的作用及機制。泛素化蛋白降解的系統

溶酶體蛋白溶解系統非溶酶體蛋白溶解系統

泛素—蛋白酶系統鈣依賴性的蛋白溶解系統

泛素、26s蛋白酶體、酶系統(E1、E2、E3、E4、泛素C—末端水解酶)

普遍存在于原核生物和真核生物細胞中，是真核細胞內最重要的非溶酶體性的蛋白溶解系統主要功能是降解機體正常情況下特別是應激狀態下產生的異常細胞漿內短壽命蛋白質，包括一些重要的調節蛋白如轉錄因子、細胞周期調節因子和信號轉錄因子等。

（特異性低）（特異性高）泛素

泛素是一種小蛋白，只有76個氨基酸（MW8.6KD）。目前發現所有生物的泛素都是由氨基酸編碼的，而且序列相當保守。比較人與酵母的泛素序列，只有3個氨基酸不同。泛素的二級結構包括了5個β-折疊，3-5個α螺旋及7個反螺旋，其外觀是一個緊密壓縮的球狀蛋白質，從球體的表面伸出4個C-末端殘基，作為泛素化蛋白質的結合位點.

泛素肽鏈中約70%由氫鍵組成，決定了它的熱穩定特性及耐受寬范圍的pH值。泛素的功能位點是C-末端，用以結合蛋白質，而其Lys-48則作為其它泛素的結合位點，用以形成泛素鏈。

甘氨酸殘基C-末端殘基Positivecharged酶系統

泛素-激活酶（Ubiquitin-ActivatingEnzyme,E1）：在人類僅發現一種，主要功能是激活泛素;

泛素-結合酶(Ubiquitin-ConjugatingEnzyme,E2)：分子量較小，都有一個UBC結構域，可特異識別泛素，并與泛素結合，同時還具有識別E3的功能;

泛素-蛋白連接酶(Ubiquitin-ProtinLigases,E3)：一類大分子蛋白質，結構復雜，主要作用是特異識別靶蛋白，并將其傳遞給蛋白酶體降解;

泛素鏈組裝因子(UbiquitinChian-AssemblyFactor,E4)：結合泛素并催化E1、E2、和E3的組裝,對多聚泛素鏈的延長起重要作用。

2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity泛素C末端水解酶（UCHs）UCHs多為含巰基蛋白酶，分子量大小不等，能特異識別泛素C末端區域，解離泛素與靶蛋白的結合,促進泛素再循環，所以對泛素系統的正常運行很必要。

蛋白酶體（26s）包括一個20s的中心顆粒和一個19s的調節顆粒，在20s顆粒中心由七個亞基的四個環組成一個中空室。α亞基主要用于底物識別，β亞基主要參與底物降解。蛋白酶體泛素-蛋白酶體系統的作用途徑

Westernblotting

顯示泛素化帶型類泛素化Sumoylation2023/7/14WanghsSunYat-senUniversitySUMO化蛋白

SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)是一種小的泛素相關修飾蛋白，它與泛素在序列上雖只有18％相同，但在二級結構和三級結構上有驚人的相似。

SUMO化（sumoylation）的功能與泛素化(ubiquitination)不同，它并不使蛋白降解，反而加強它們的穩定性或調節它們在細胞內的定位和分布.SUMO家族成員包括SUMO-1，SUMO-2，SUMO-3。它們廣泛存在于原生動物、后生動物、植物和真菌中，顯示了SUMO在進化上的保守性。

SUMO家族成員都有獨特的N端氨基酸序列和碳端外延序列。在所有的SUMO家族成員中，甘氨酸－甘氨酸殘基對SUMO結合是必須的。

2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity

SUMO-1的三級結構包括一個與泛素同源區域（氨基酸序列22－97）。這段序列緊緊的塞在泛素的一個superfold中，還有一個高度靈活的N端在類似泛素的中心突出。形成異肽鍵所需的甘氨酸殘基在泛素和SUMO-1中是保守的。在體內，甘氨酸殘基很容易被C－端水解酶分解。甘氨酸殘基PositivechargedNegativechargedN-terminalPositivecharged甘氨酸殘基C-末端殘基C-末端殘基2023/7/14WanghsSunYat-senUniversity

當SUMO被E1活化酶活化時，其碳端的苷氨酸殘基發生ATP供能的腺甘酸化；隨后，在SUMO的碳端和E1的絲氨酸殘基形成一個硫脂的結合，并釋放出AMP。在這一酯基反應中，SUMO被轉移到E2連接酶UBC9上；UBC9與SUMO硫脂的結合促進SUMO的碳端和底物蛋白的Lys殘基形成一個牢固的異肽結合。有的SUMO底物蛋白需要E3聯接酶來促進它們的SUMO化,有的不需要E3。一般E3酶都不直接與SUMO結合，它只結合UBC9和底物蛋白，從而促進SUMO與底物蛋白結合，完成SUMO化。2023/7/14WanghsSunYat-senUniversitySUMO的生物學功能

1,調節蛋白之間的相互作用2,調節蛋白在核漿間的轉運3,調節蛋白的轉錄活性4,拮抗泛素化，使蛋白穩定2023/7/14WanghsSunYat-senUniversityI-κB是SUMO的一個底物蛋白，它既能發生SUMO化，又能發生泛素化，而且由于SUMO化和泛素化的位點都是K21,SUMO會和泛素競爭結合位點。I-κB是NF-κB的抑制因子，NF-κB在胞漿中由于和I-κB結合呈現無活性的狀態。I-κB經腫瘤壞死因子TNF的刺激，在S32和S36發生磷酸化，進而被泛素化。I-κB的降解使得NF-κB的入核序列暴露，從而進入細胞核激活NF-κB的靶基因。但是當I-κB被SUMO修飾后卻能免受TNF誘導的降解，使NF-κB－I-κB－SUMO復合體繼續穩定的存在于胞漿中，進而抑制NF-κB的轉錄活性。I-κBNF-κBSUMOUbiquitinationTNFNF-κBI-κBThree磷酸化在許多蛋白特別是轉錄因子中都存在磷酸化和去磷酸化作用。

轉錄因子的磷酸化、去磷酸化可能影響：

1）轉錄因子從細胞質向細胞核轉運或相反。

2）轉錄因子與特異DNA序列的結合。

3）調節轉錄因子的轉錄激活功能區與其他因子的作用。

機理：

1，磷酸化增加了反式作用因子的反式激活結構域與基礎轉錄元件或轉錄起始復合物之間的親和力。

2，磷酸化改變了轉錄活化結構域的空間構象。

3，磷酸化促使反式激活結構域與阻遏蛋白解離，或促進其與DNA結合。

4，增加蛋白質分子表面的負電荷。蛋白質磷酸化的調控機理和特點

特點：

1，迅速。

2，激酶催化的磷酸化可以被磷酸酶所逆轉。

3，能夠有效地整合來自不同轉導途徑的信號。

4，同一種激酶或磷酸酶都是多底物的，對不同轉錄因子的影響不同。

5，蛋白因子上被修飾的氨基酸殘基不同，對轉錄因子功能的影響也不同。

磷酸化研究方法特異性磷酸化抗體直接證明CIAP或OA間接證明片段缺失突變和點突變直接證明同位素標記質譜分析CIAP或OA處理細胞證明蛋白磷酸化

CIAP：牛小腸堿性磷酸酶，能夠將DNA以及蛋白上的磷酸根基團去除（孵育蛋白）；OA：岡田酸，磷酸酶抑制劑（細胞處理）片段缺失突變確定磷酸化的初步位點點突變確定磷酸化的精確位點(ForErk/MAPK)AKT:RXRXXS

TR3:RDHLAS

Motif

原理：將未被磷酸化的蛋白與被磷酸化后的蛋白用蛋白酶水解后，進行MS/MS分析，到數據庫進行比對。由于磷酸化的片段上多了磷酸基團，因此其分子量將比為被磷酸化的片段要大，由此可分析出磷酸化的位置。質譜分析蛋白磷酸化乙酰化乙酰化異常與疾病CBP/p300的突變導致RubinsteinTaybi綜合征，患者智力低下、面部畸形、姆指和拇趾粗大、身材矮小。CBP/p300可抑制腫瘤的形成，在小鼠瘤細胞中發現CBP突變，在結腸和乳房瘤細胞系中發現p300突變。如果突變導致錯誤的激活去乙酰化酶或錯誤的和去乙酰化酶相互作用，將可能導致疾病的發生。甲基化CpG-結合蛋白-2(MeCP2)可募集去乙酰化酶到甲基化的DNA區域，使組蛋白去乙酰化導致染色質濃縮。MeCP2突變導致Rett綜合征，患者出生即發病、智力發育遲緩、伴孤獨癥。阻礙去乙酰化酶的功能，則可抑制癌細胞的增殖和分化，可用于急性早幼粒細胞性白血病,急性淋巴細胞性白血病和非何杰金氏淋巴瘤的治療。蛋白乙酰化的作用是維持染色質的開放結構，因而有利于轉錄因子與靶DNA結合，進而促使基因的轉錄。蛋白去乙酰化酶HDACs可移去H3H4賴氨酸上的乙酰基，使帶正電荷的賴氨酸殘基暴露，從而增強與DNA的相互作用。而帶正電荷的賴氨酸殘基與DNA之間的相互作用可限制核小體在DNA之間的移動，使啟動子接近轉錄調控元件，組蛋白低乙酰化使染色質失去轉錄活性。蛋白乙酰化的作用Motif:GK,SK蛋白轉運和分布研究

Proteintranslocation

Proteinshuttling

Proteintraffic

蛋白質的轉運過程

靶向(targeting)

去折疊分子識別跨膜轉運分選和定位(sortingandlocalization)

重折疊組裝（在去折疊和重折疊中還有分子伴侶

(molecularchaperone)的參與)靶向運送的信息來自于：1,信號肽(也包括靶向線粒體的導肽leadersequence)2,運送蛋白質分子本身的某些片段如nuclareexportsequencenuclearlocationsequence3,分泌蛋白自身的信息

蛋白質

細胞質細胞核

蛋白質的合成是在核糖體上進行的，但是合成后的蛋白質必須定向的、準確無誤地運送到特定的細胞器和細胞核中，才能保證細胞活動的正常進行。蛋白入核轉運

分子量小于45-50KD的蛋白：在不需要外界能量供應的前提下可以通過核孔自由進出（被動擴散）；分子量大于50KD的蛋白：①依賴于能量和溫度；②需要胞漿運輸因子；③需要核孔復合體蛋白（主動運輸）；核定位序列

（nuclearlocalizationsequence,NLS）①單一型NLS，由一段連續的堿性氨基酸順序排列而成（RKKKRKV）②雙分型NLS，由兩簇堿性氨基酸被中間10－12個非保守性氨基酸所分隔而形成（KRPAATKKAGQAKKKKLDK）

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importin-proteinimportin-importin-cytoplasmNPCimportin-proteinimportin-NucleusnucleoprotinIBBIBBGTPaseRan/TC42023/7/1