第第頁對遺傳學診斷的分析論文一、運用單細胞雙重巢式PCR和MDA技術方法行性連鎖遺傳病診斷

1、提取男女單個淋巴細胞各150例，共300個細胞。隨機分成3組，每組男女細胞各50個，雙重巢式PCR技術在單細胞水平同時擴增X類固醇硫酸脂酶基因(steroidsulfatasegene，STS)/Y假基因和牙釉質基因(Amelogenin，AMEL)，對比組用單重巢式PCR技術在單細胞水平分別擴增兩基因，比較單、雙重巢式PCR技術在單細胞水平的擴增率及性別診斷正確率。

2、應用MDA擴增5個單個淋巴細胞和10個單個卵裂球全基因組DNA，1%的瓊脂糖電泳檢測擴增效率，通過一般PCR即上述巢式PCR的其次輪的PCR條件檢測細胞性別來推斷擴增產物的均一性。結果1、單重巢式PCR擴增男性細胞STS和AMEL的擴增率和細胞性別診斷的正確率分別是84%、76%和84%、84%;而雙重巢式PCR技術同時擴增上述基因的擴增率和性別診斷正確率分別為98%、96%。后者與前兩者相比擴增率和性別診斷正確率均明顯提高，差異均有統計學意義(P0.05、P0.01)。

3、MDA擴增5個淋巴細胞(3個為男性細胞，2個為女性細胞)全部擴增勝利，擴增率100%;MDA擴增10個卵裂球有4個擴出產物，擴增率為40%。以MDA產物為模板，用STS的其次輪引物檢測單個淋巴細胞性別，正確性為100%;檢測全部擴出產物的卵裂球也均能檢測出性別，發覺2個為男性，2個為女性，惋惜的是這4個卵裂球均來自不同的胚胎，所以不能互相驗證。從淋巴細胞MDA產物檢測的結果可以推斷MDA產物也是均一的。結論1、在單細胞水平性連鎖遺傳疾病診斷中，雙重巢式PCR技術較單重巢式PCR技術具有較高的擴增率及診斷正確率，并有助于發覺等位基因脫扣(alleledropout，ADO)。該法在無創性單基因伴性遺傳病的產前診斷和植入前遺傳學診斷中具有較高的實際應用價值，且經濟、便捷，值得臨床進一步推廣。

4、初步預試驗可知MDA可以克服單細胞的模板量少和不行重復試驗的缺點。但由于此次預試驗的樣本量太小，其穩定性、牢靠性還需進一步摸索，才可以用于單基因病的著床前遺傳學診斷和產前診斷。

二、利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行無創性地中海貧血產前基因診斷的討論

方法：收集157例孕婦的外周血，利用柱汲取的方法提取血漿中的cffDNA，經瓊脂糖凝膠電泳分別富集小片段cffDNA，使用二重PCR反應(dulexPCR)檢測SRY基因和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceroldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH)基因。結果來源于86例孕男胎的孕婦血漿標本的小片段cffDNA均檢出SRY和GAPDH基因，來源于71例孕女胎的孕婦血漿標本的小片段cffDNA只檢出GAPDH基因。與絨毛/羊水標本檢測結果以及產后隨訪結果相符。特異性和敏感性分別為100%(157/157)和100%(86/86)。結論利用瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，可以選擇性富集孕婦外周血中的小片段cffDNA，相對地提高胎兒DNA的含量，結合二重PCR擴增SRY基因技術可用于無創性產前性連鎖遺傳疾病和單基因突變疾病的產前診斷。其次部分利用孕婦外周血漿中cffDNA進行STRPCR檢測胎兒基因型目的：利用小片段cffDNA進行D5S818、D7S820、D13S317三個短串聯重復序列(shorttandemrepeat，STR)基因型的分析，觀看提取出來的小片段cffDNA中母源性DNA背景對試驗的影響。

方法：收集了62例孕婦外周血標本，提取小片段游離胎兒DNA，利用多重PCR(mutilplexPCR)的方法分析胎兒的.STR基因型，并與父母基因型相比對。結果：62例小片段cffDNA的擴增結果中，49例標本的擴增結果完全與父母基因型相匹配，未發覺母源性DNA的污染。其余13例在D13S317基因座的擴增中消失了母源性DNA的污染。

結論：經過對小片段cffDNA進行富集后，仍有可能消失母源性DNA對試驗的影響，并且可能影響對試驗結果的判讀。使用多重PCR反應結合多基因座的擴增，可能可以有助于削減母源性DNA的影響，有助于結果的判讀。第三部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行β地中海貧血無創性產前基因診斷目的：利用cffDNA對胎兒進行廣西、廣東地區常見的17種β地中海貧血基因型的檢測，與傳統創傷性產前診斷相比較，探討該方法的精確性和可行性。方法：針對廣西、廣東地區常見的β地中海貧血突變的基因型設計三對不同引物，并用生物素標記。對cffDNA進行二次PCR反應后，使用反向斑點雜交(revertdotblothybridization，RDB)檢測胎兒的β珠蛋白基因型，與創傷性產前診斷結果比較，觀看精確率。

結果：37例cffDNA標本檢測中，檢出重型β地中海貧血19例，輕型β地中海貧血11例，正常7例，與創傷性產前診斷結果相比較消失3例誤診，精確率為91.9%(34/37)。結論：利用cffDNA進行β地中海貧血的檢測，可能消失母源性DNA背景的污染，當胎兒基因型與母親基因型相同時，必需提高警惕，進一步分析或者復查。由于該技術取樣簡單，對孕婦胎兒無風險，不受孕期時間影響，易為與孕婦接受，因此進一步改良該技術后有望可用于β地中海貧血的診斷。第四部分利用孕婦外周血漿中小片段游離胎兒DNA進行巴氏水腫胎兒檢測目的：通過檢測cffDNA以及母源性cfDNA在PCR反應中擴增效率的不同，進行檢測巴氏水腫胎兒(HbBart’shydropsfoetus)的方法學討論。方法：對來源于擬診孕水腫胎兒孕婦的小片段cffDNA，進行熒光PCR(FluorescencePCR)擴增，利用毛細管電泳(capillaryelectrophoresis，CE)技術推斷兩種產物峰面積比(peakarearatio)來檢測巴氏水腫胎兒。結果：30例擬診巴氏水腫胎兒的小片段