關于物質的能量轉換線粒體第1頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三第一節線粒體與氧化磷酸化線粒體被稱為細胞內的能量工廠。人體內的細胞每天要合成幾千克的ATP，95%是由線粒體中的呼吸鏈所產生。線粒體通過氧化磷酸化，進行能量轉換。第2頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三線粒體發現及功能研究簡史1890年Altaman發現線粒體,命名為bioblast。1898年Benda將這種顆命名為mitochondrion。1900年L.Michaelis發現線粒體具有氧化作用。1948年Green證實線粒體含所有三羧酸循環的酶。1949年Kennedy發現脂肪酸氧化是在線粒體內完成。1976年Hatefi等純化了呼吸鏈四個獨立的復合體。1961-1980年Mitchell提出氧化磷酸化化學偶聯學說。第3頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三一、線粒體的形態結構（一）形態、大小、數量和分布1.形態：粒狀或桿狀，因種類和生理狀態，可呈環形，啞鈴形、線狀、分杈狀。2.大?。褐睆?.5~1μm，長1.5~3.0μm，胰臟分泌細胞中可長達10~20μm，稱巨線粒體。人成纖維細胞則更長，可達40μm。線粒體形狀與大小也隨著代謝條件不同而改變。第4頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三3.數量：不同類型細胞中M相差大，有的僅1個，有的數百或數千，同類型細胞中數目穩定。在代謝活躍的細胞中數量多；植物常較動物少；紅細胞中無線粒體。4.分布：常均勻分布在胞質，但也有不均勻分布，常集中在代謝活躍的區域。M常結合在微管上，可向功能旺盛區域遷移。第5頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三線粒體大小和數量反映了細胞能量需求

線粒體位于心肌細胞和精子尾部需能多的部位第6頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三活細胞中線粒體形態高度可變

第7頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（二）線粒體的結構線粒體由內外兩層單位膜封閉形成，包括外膜、內膜、膜間隙和基質4個部分。第8頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三線粒體結構模型

第9頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三1、外膜(outmembrane)全封閉的單位膜，厚6nm，脂和蛋白含量近相等;具孔蛋白(porin)構成的親水通道，分子量<5KD分子可通過。外膜通透性較高，膜間隙環境和cytosol中相似。具一些特殊酶類，如色氨酸降解的酶、脂肪鏈延伸的酶。標志酶為單胺氧化酶。第10頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三2、內膜（innermembrane）厚約6-8nm，通透性低，僅讓不帶電荷小分子通過，大分子和離子通過內膜需特殊轉運系統。蛋白質/脂類>3:1。心磷脂含量20%、無膽固醇。氧化磷酸化的電子傳遞鏈位于內膜。第11頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三內膜向基質褶入形成嵴(cristae)，嵴有2種類型：①板層狀；②管狀。多呈板層狀。嵴上有基粒，基粒由頭部(F1)和基部(F0)構成，F0嵌入內膜。內膜具豐富的酶，主要是參與電子傳遞與ATP合成的酶類，及參與運輸與合成的酶類，標志酶為細胞色素C氧化酶。第12頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三板層狀結構第13頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三管狀嵴線粒體

第14頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三3、膜間隙(intermembranespace)寬6-8nm，含大量可溶性酶、底物和輔助因子膜間隙的pH值與胞質相似。標志酶為腺苷酸激酶，催化ATP分子的末端磷酸基團轉移到AMP第15頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三4、基質（matrix）除糖酵解外，其它生物氧化的酶均在基質中：TCA循環、脂肪酸和丙酮酸氧化的酶。標志酶為蘋果酸脫氫酶。含一套完整的轉錄和翻譯體系：mtDNA，70S核糖體，tRNA、rRNA、DNA聚合酶、氨基酸活化酶等。第16頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三二、線粒體的功能是糖類、脂肪和氨基酸最終的氧化場所。物質先在胞質中經一系列降解形成丙酮酸和脂肪酸，進入線粒體，再經一系列分解形成乙酰輔酶A，進入三羧酸循環。主要功能是進行氧化磷酸化，合成ATP第17頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三(一)真核細胞中的氧化作用(oxidation)葡萄糖和脂肪酸是真核細胞能量的主要來源。1.糖的氧化:分為3個階段：

1)在胞質中，糖氧化生成丙酮酸；

2)丙酮酸進入線粒體，脫羧生成乙酰CoA3)乙酰CoA進入TCA循環，徹底氧化第18頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三2.脂肪的氧化：在胞質中水解成脂肪酸，脂肪酸進入線粒體基質，通過β氧化途徑生成乙酰CoA，及1分子NADH和FADH2。乙酰輔酶A是線粒體能量代謝的核心分子。第19頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三3.TCA循環：乙酰CoA和草酰乙酸結合成一個含3個羧酸的檸檬酸，檸檬酸經氧化脫羧，經酮戊二酸、琥珀酸，降解成草酰乙酸，每循環一次生成2分子CO2、一分子GTP、4分子NADH和一分子FADH2。第20頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三4.輔酶在能量傳遞中的作用:TCA循環的凈產物是FADH2和NADH，含循環中底物氧化釋放的電子，共5對，可用于ATP合成。胞質糖酵解也產生NADH，可通過蘋果酸-天門冬氨酸穿梭和甘油-磷酸穿梭，將電子傳遞給線粒體的FAD，形成FADH2，參與ATP合成。第21頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三(二)呼吸鏈與電子傳遞呼吸鏈(respiratorychain)，是內膜上的一組酶復合體。功能是進行電子、H+的傳遞及氧的利用，產生H2O和ATP。TCA循環后，大部分能量儲在NADH和FADH2中，需將還原型輔酶氧化才能將能量釋放出，該過程涉及電子從NADH或FADH2傳遞到氧。第22頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三在內膜中一系列的電子載體進行的電子傳遞過程中，NADH或FADH2所含能量逐步釋放，最后儲存在ATP的高能磷酸鍵中。電子經呼吸鏈流動稱電子傳遞，ADP轉變成ATP稱磷酸化，兩者的偶聯即氧化磷酸化。第23頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（三）氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)的分子基礎

第24頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三1、電子載體與電子結合并將其傳遞下去的物質:電子載體。呼吸鏈電子載體：黃素蛋白、細胞色素、銅原子、鐵硫蛋白、輔酶Q。(1)

NAD：煙酰胺嘌呤二核苷酸，脫氫酶的輔酶，連接TCA循環和呼吸鏈，將氫交給黃素蛋白。第25頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三NAD的結構和功能:NAD＋：R＝H，NADP＋：R＝H2PO3-

第26頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三(2)黃素蛋白(flavoprotein)：由一條多肽鏈結合一個輔基組成的酶類,輔基為FMN或FAD，每個FMN或FAD可接受2個電子和2個質子。呼吸鏈上有以FMN為輔基的NADH脫氫酶，以FAD為輔基的琥珀酸脫氫酶。第27頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三

FMN(flavinmononucleotide)的分子結構第28頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三FAD(flavinadeninedinucleotide)的分子結構

第29頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三(3)細胞色素(cytochrome)：含血紅素鐵，以Fe3+和Fe2+互變傳遞電子，呼吸鏈中有5類細胞色素:a、a3、b、c、c1；a、a3含銅原子。血紅素基團的鐵可傳遞單個電子aa3分子中,還含2個銅原子,靠其化合價的變化,把電子從a3傳遞到氧第30頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三血紅素的結構

第31頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三(4)

鐵硫蛋白(Fe/Sprotein)：屬細胞色素類，分子中央結合的是鐵和硫，非血紅素，稱鐵硫中心。一般含4個原子，2個鐵和2個S，稱2Fe-2S，也有4Fe-4S。也是通過Fe2+、Fe3+互變進行電子傳遞，且一次只能傳遞1個電子

第32頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三第33頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三(5)輔酶Q(coenzymeQ)：脂溶性小分子醌類化合物，通過氧化和還原傳遞電子。有3種氧化還原形式：氧化型醌Q，還原型氫醌(QH2)和介于兩者間的半醌(QH)。每個醌能接受和傳遞2個電子和質子第34頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三

輔酶Q

第35頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三2、氧化還原電位與載體排列順序同種物質得失電子的兩種狀態稱氧還對。如NAD+和NADH，兩者間有電位差，即氧還電位可在標準條件下測定標準氧還電位。標準氧還電位越小，提供電子的能力越強通過測定電子載體的氧化還原電位，可推斷其在呼吸鏈中的排列順序第36頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三3、電子傳遞復合物用脫氧膽酸(離子型去污劑)處理內膜、分離出呼吸鏈的4種復合物，即復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，輔酶Q和細胞色素C不屬于任何一種復合物。輔酶Q溶于內膜，細胞色素C位于內膜的膜間隙側(C側)，屬膜外周蛋白。第37頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（1）復合物ⅠNADH脫氫酶，哺乳動物中由42條肽鏈組成。含1個FMN和6個Fe/S，以二聚體存在。作用：催化NADH的2個電子傳至輔酶Q，并將4個H+由基質(M側)→膜間隙(C側)。電子傳遞方向：NADH→FMN→Fe-S→Q結果：NADH+5H+(M)+Q→NAD++QH2+4H+(C)第38頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（2）復合物Ⅱ琥珀酸脫氫酶，4條肽鏈，含1個FAD，2個Fe/S傳遞低能電子，催化電子從琥珀酸→CoQ，傳遞過程：琥珀酸→FAD→Fe-S→Q。不轉移質子。反應結果為：琥珀酸+Q→延胡索酸+QH2第39頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（3）復合物ⅢCoQ-cytc還原酶，由11條不同肽鏈組成，以二聚體存在，單體含2個cytb(b562，b566)、一個cytc1和一個Fe/S。作用：催化電子從輔酶Q→cytc，每轉移一對電子，同時將4個H+轉移至膜間隙。結果：2氧化態cytc1+QH2+2H+(M)→2還原態cytc1+Q+4H+(C)第40頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三復合物Ⅲ的電子傳遞和“Q循環”有關輔酶Q能在膜中自由擴散，在內膜C側，QH2將一個電子交給Fe-S→細胞色素c1→細胞色素c，被氧化為半醌(QH)，并將一個質子釋放到膜間隙，半醌將電子交給細胞色素b566→b562，釋放另外一個質子到膜間隙。cytb566得到的電子為循環電子，傳遞路線為：半醌→b566→b562→輔酶Q。在內膜M側，輔酶Q可被復合體Ⅰ（復合體Ⅱ）或cytb562還原為氫醌。一對電子由輔酶Q到復合物Ⅲ的電子傳遞過程中，共有四個質子被轉移到膜間隙，其中兩個質子是輔酶Q轉移的。第41頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三Q循環示意圖

第42頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（4）復合物Ⅳcytc氧化酶，以二聚體存在，單體含1個cyta、a3和2個Cu原子。作用：將電子從cytc→氧。傳遞路線：cytc→CuA→hemea→a3-CuB→O2每轉移一對電子，從基質中攝取4個H+，其中2個用于水形成，另2個被轉至膜間隙。結果：

4還原態cytc+8H+(M)+O2→4氧化態cytc+4H+(C)+2H2O第43頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三4、兩條主要的呼吸鏈呼吸鏈傳遞的主要是NADH，而FADH2較少，可將呼吸鏈分為主、次兩條：主鏈由復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組成，催化NADH氧化次鏈由復合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組成，催化琥珀酸氧化第44頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三兩條主要的呼吸鏈第45頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三A.Molecularbasisofoxidation:Electron-transportchain第46頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（二）ATP合酶(ATPsynthetase)的結構和作用機理F0F1-ATP酶，是生物能量轉化的核心酶。參與氧化磷酸化和光合磷酸化，催化合成ATP。也存在線粒體內膜、葉綠體類囊體膜、異氧菌和光合菌質膜上。膜結合狀態下具有ATP合成活性，分離狀態下具水解ATP的活性。第47頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三1.ATP合酶的結構(1)F1:由5種多肽組成的九聚體(3α3βγδε)，α和β單位交替排列，如桔瓣。γ貫穿αβ復合體，并與F0接觸，ε幫助γ與F0結合。δ與F0的兩個b亞基形成固定αβ復合體的結構。具3個ATP合成催化位點,每個β亞基一個。(2)F0:由3個亞基組成的15聚體(1a:2b:12c)。c亞基在膜中形成物質運動的環，b亞基與δ固定F1；a亞基是質子通道。第48頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三ATP合酶的結構F1:5subunitsintheratio3:3:1:1:1F0:1a：2b：12c

第49頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三F1和F0通過轉子和定子聯系起來，在合成或水解ATP時，轉子在通過F0的H+推動下,依次與3個β亞基作用，調節β亞基催化位點構象變化；定子在一側將α3β3與F0連接起來。F0的作用之一,利用跨膜質子勢轉換成扭力矩，推動轉子旋轉.第50頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三第51頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三2.氧化磷酸化與電子傳遞的偶聯呼吸鏈中有3個部位自由能變化較大，是呼吸鏈氧化還原放能與ATP合成偶聯部位，可被特異性抑制劑阻斷。復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ每傳遞一對電子，釋放的自由能都足夠合成1分子ATP，這三個復合物是呼吸鏈中電子傳遞與氧化磷酸化偶聯的3個位點，各處生成1分子ATP。NADH呼吸鏈有3個偶聯位點，可生成3個ATP.FADH2呼吸鏈只合成2分子ATP，因為復合物Ⅱ不是ATP合成的偶聯位點。第52頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三SummaryofthemajoractivitiesduringaerobicrespirationinamitochondrionNADHO2:3ATP/2e;FADH2O2:2ATP/2e第53頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三3.生物氧化產生ATP的統計一個葡萄糖分子經細胞呼吸全過程產生的ATP

糖酵解：底物水平磷酸化產生4ATP（胞質）

己糖分子活化消耗2ATP（胞質）

產生2NADH，經電子傳遞產生4或6ATP

凈積累6或8ATP

丙酮酸氧化脫羧：產生2NADH(M)，生成

6ATP

三羧酸循環：底物水平的磷酸化產生(M)2ATP；

產生6NADH（M），生成18ATP；

產生2FADH2（M），生成4ATP

總計生成36或38ATP

第54頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（三）氧化磷酸化的偶聯機理氧化與磷酸化的偶聯機制一直是研究氧化磷酸化作用的關鍵主要的假說有：1、化學滲透學說(chemiosmoticcouplinghypothesis)2、構象偶聯假說(conformationalcouplinghypothesis)第55頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三1、化學滲透假說：質子動力勢MitchellP.1961提出“化學滲透假說(ChemiosmoticHypothesis)”，70年代化學滲透假說得到大量實驗的支持，成為一種較為流行的假說，Mitchell也因此獲得1978年諾貝爾化學獎。第56頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三化學滲透學說：電子沿呼吸鏈傳遞時，釋放的能量將質子從內膜基質側泵至膜間隙，線粒體內膜對離子高度不通透，使膜間隙的H+濃度高于基質，在內膜兩側形成pH梯度(△pH)及電位梯度(Ψ)，共同構成電化學梯度，即質子動力勢(△P)。

△P=Ψ-(2.3RT/F)△pH

T為絕對溫度，R為氣體常數，F為法拉第常數質子沿電化學梯度穿過內膜上的ATP合酶流回基質，使ATP合酶構象改變，將ADP和Pi合成ATP第57頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三

化學滲透學說第58頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三第59頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三Mithchell’sChemiosmotictheory(1961)Morethan21026molecules(>160kg)ofATPperdayinourbodies.第60頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三Otherrolesfortheproton-motiveforceinadditiontoATPsynthase第61頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三2、構象耦聯假說1979年Boyer提出構象耦聯假說，要點有：1．ATP酶利用質子動力勢，產生構象的改變，改變與底物的親和力，催化ADP與Pi形成ATP。2．F1有三個催化位點，三個催化位點的構象不同、與核苷酸的親和力不同。在L構象(loose)，ADP、Pi與酶疏松結合；在T(tight)構象與酶緊密結合；在O構象(open)ATP與酶的親和力低，被釋放。3．質子通過F0時，引起c亞基構成的環旋轉，帶動γ亞基旋轉，γ亞基端部高度不對稱，它的旋轉引起β亞基3個催化位點構象的周期性變化(L、T、O)。每個亞基要經過3次構象改變才能催化合成1個ATP。第62頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三第63頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三第64頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三TheATPsynthaseisareversiblecouplingdevice

第65頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三支持構象耦聯假說的實驗有：1．日本的吉田（MassasukeYoshida）等人將α3β3γ固定在玻片上，在γ亞基的頂端連接熒光標記的肌動蛋白纖維，在含有ATP的溶液中溫育時，在顯微鏡下可觀察到γ亞基帶動肌動蛋白纖維旋轉。2．在另外一個實驗中，將熒光標記的肌動蛋白連接到ATP合酶的F0亞基上，在ATP存在時同樣可以觀察到肌動蛋白的旋轉。第66頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三γ亞基旋轉的觀察第67頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三（四）氧化磷酸化抑制劑電子傳遞抑制劑可用來研究呼吸鏈各組分的排列順序，當呼吸鏈某一特定部位被抑制，底物一側均為還原態，另一側均為氧化態，可用分光光度計檢測，各組分氧化態和還原態具不同的吸收峰。1.電子傳遞抑制劑:包括以下類型：①抑制NADH→CoQ電子傳遞:阿米妥、魚藤酮、殺粉蝶素A。②抑制Cytb→Cytc1電子傳遞:抗霉素A③抑制細胞色素氧化酶→O2:CO，CN，NaN3，H2S第68頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三2．磷酸化抑制劑:與F0結合結合，阻斷H+通道，從而抑制ATP合成：寡霉素、二環己基碳化二亞胺(DCC)3．解偶聯劑(uncoupler):使氧化和磷酸化脫偶聯，氧化仍可進行，而磷酸化不能進行。解偶聯劑為離子載體或通道，能增大內膜對H+通透性，消除H+梯度，無ATP生成，使氧化釋放出的能量全部以熱的形式散發動物棕色脂肪組織和肌肉線粒體中有獨特的解偶聯蛋白，與維持體溫有關。第69頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三常用解偶聯劑主要有：質子載體：2，4-二硝基酚(DNP)，羰基-氰-對-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。質子通道:增溫素。其它離子載體：纈氨霉素。某些藥物：如過量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶聯，從而使體溫升高。第70頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三三、線粒體的半自主性63年發現線粒體DNA(mtDNA)后，又在線粒體發現RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖體等進行DNA復制、轉錄和蛋白質翻譯的全套裝備，說明線粒體具獨立遺傳體系。線粒體能合成蛋白質，但合成能力有限。線粒體1000多種蛋白質中，自身合成的僅十余種。線粒體核糖體蛋白、氨酰tRNA合成酶、許多結構蛋白，都是核基因編碼，在胞質中合成，定向轉運到線粒體，故稱線粒體為半自主細胞器。第71頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三利用標記氨基酸培養細胞，用氯霉素和放線菌酮分別抑制線粒體和胞質蛋白質合成，發現人的mtDNA編碼的多肽為細胞色素c氧化酶的3個亞基，F0的2個亞基，NADH脫氫酶的7個亞基和細胞色素b等13條多肽。mtDNA還合成12S和16SrRNA及22種tRNA。第72頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三mtDNA分子為環狀雙鏈DNA，外環為重鏈(H)，內環為輕鏈（L）。基因排列非常緊湊，大多數基因無內含子序列。基因組變化較大，動物細胞mtDNA較小，約16.5kb，酵母達80kb。每個細胞含幾百個線粒體，每個線粒體又含多個mtDNA，但mtDNA的總量不到核基因組的1%.第73頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三多數基因由H鏈轉錄，包括2個rRNA，14個tRNA和12個編碼多肽的mRNA。L鏈編碼另外8個tRNA和一條多肽鏈。mtDNA上的基因相互連接，一些多肽基因相互重疊，幾乎所有閱讀框都缺少非翻譯區域。很多基因沒有完整的終止密碼，僅以T或TA結尾，mRNA終止信號是在轉錄后加工加上去第74頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三GenesinmtDNAencoderRNAs,tRNAs,andsomemitochondrialproteinsHumanmtDNA:16,569bp2rRNAs,22tRNAs,13polypeptides:NADHreductase.7sub.Ctyb-c1complex.1cytbCytoxidase.3subunitsATPsynthase:2F0sub

第75頁，講稿共99頁，2023年5月2日，星期三線粒體在形態、染色反應、化學組成、物理性質、遺傳體系等方面，都很像細菌，所以推測其起源于內共生。在進化過程中好氧細菌逐步喪失了獨立性，并將大量遺傳信息轉移到了宿主細胞中，形成了半自主性。線粒體遺傳體系和細菌相似的特征：①DNA