測定和評估食品中所含的蛋白質及氨基酸食品分析與檢驗技術2技能目標1．會測定食品中粗蛋白含量。2．會測定食品中氨基酸總量。3．會測定食品中不同氨基酸含量。知識目標1．明確常見的食品蛋白質含量，以及測定原理。2．明確食品氨基酸總量的含量，以及測定原理。食品分析與檢驗技術3項目一：測定食品中蛋白質一、案例二、選用的國家標準食品中蛋白質的測定——凱氏定氮法。食品分析與檢驗技術4三、測定方法1．樣品消化準確稱取固體樣品～2g,半固體樣品2～5g，液體樣品10～25g，使試樣中含氮30～40mg（精確至），小心移入干燥潔凈的100mL或500mL凱氏燒瓶中，然后依次加硫酸銅、硫酸鉀6g、濃硫酸20mL、玻璃珠數粒，輕輕搖勻后，安裝消化裝置。將凱氏燒瓶45°斜放在電爐上，于瓶口放一漏斗，緩慢加熱，待內容物全部炭化，泡沫停止后，加大火力，保持液面微沸至溶液呈藍綠色透明時，繼續加熱～1h，取下凱氏燒瓶冷卻后，緩慢加入20mL水，冷卻至室溫。食品分析與檢驗技術52．蒸餾、吸收（1）常量蒸餾：裝好蒸餾裝置。接收瓶內加入10mL4%硼酸溶液及4～5滴甲基紅-溴甲酚綠混合指示液，置于蒸餾裝置的冷凝管下口，并使冷凝管下口浸入硼酸溶液中。放松夾子，沿漏斗向凱氏燒瓶中緩慢加入70～80mL40%氫氧化鈉溶液，搖動凱氏瓶，至瓶內溶液變為深藍色，或產生黑色沉淀，再從漏斗加入100mL蒸餾水，夾緊夾子。加熱蒸餾，蒸餾30min(始終保持液面沸騰)，至氨全部蒸出(約250mL蒸餾液)。降低接收瓶的位置，使冷凝管口離開液面，繼續蒸餾1～3min，用表面皿接幾滴溜出液，以奈氏試劑檢查，如無紅棕色生成，表示蒸餾完畢。停止加熱，用少量水沖洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶內，取下接收瓶，用的鹽酸標準溶液滴定至終點；同時做空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸標準溶液體積。食品分析與檢驗技術6食品分析與檢驗技術7（2）微量蒸餾：安裝好定氮蒸餾裝置。在水蒸氣發生瓶中裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升，保持水呈酸性（淡紅色），加熱煮沸，將樣品消化液轉移到100mL容量瓶中并定容、搖勻。接收瓶內加入10mL4%硼酸溶液和1滴混合指示劑，置于蒸餾裝置的冷凝管下口，浸入硼酸溶液中，取2～10mL稀釋樣液，移入反應室，并用少量蒸餾水沖洗，塞緊玻璃塞，然后向反應室加入10mL400g/L氫氧化鈉溶液，立即塞緊玻璃塞，加水密封。蒸餾至硼酸吸收液中指示劑變為綠色開始計時，繼續蒸餾10min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，沖洗冷凝管管口。取下接收瓶，用的鹽酸標準溶液滴定至終點，同時做空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸標準溶液體積。食品分析與檢驗技術8食品分析與檢驗技術93．結果計算常量蒸餾按下式計算:微量蒸餾按下式計算：式中X——食品中蛋白質質量分數，%；V——滴定試樣時消耗鹽酸標準滴定溶液的體積，mL；V0——空白試驗時消耗鹽酸標準滴定溶液的體積，mL；c——鹽酸標準滴定溶液的濃度；0.014——氮的毫摩爾質量，g/mmol；m——試樣的質量，g；F——氮換算為蛋白質的系數。食品分析與檢驗技術104．試劑硫酸銅CuSO4·5H2O、硫酸鉀、硫酸(密度為1.8149g/L)、40g/L硼酸溶液、400g/L氫氧化鈉、鹽酸標準溶液、混合指示劑混合指示劑：1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L亞甲基藍乙醇溶液，用時按2:1的比例混合；或者1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L溴甲酚綠乙醇溶液，用時按1:5的比例混合。5．實驗儀器凱氏燒瓶（100mL或500mL）、可調式電爐、定氮蒸餾裝置。食品分析與檢驗技術11四、相關知識（一）食品中蛋白質含量測定——凱氏定氮法原理將被檢樣品加入濃硫酸，以硫酸銅、硫酸鉀為催化劑共同加熱消化，食品中蛋白質分解為氨，并與硫酸結合成硫酸銨，通過堿化蒸餾，使氨分離出來，用硼酸吸收形成硼酸氨后，再用鹽酸標準溶液滴定，根據消耗的標準鹽酸的體積，通過換算系數，可測定食品中蛋白質含量。本法摘自，適用于所有動、植物食品的蛋白質含量測定。食品分析與檢驗技術12（二）樣品消化反應過程1．樣品消化、蒸餾、滴定反應過程消化反應方程式：

2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O2H2SO4+C→CO2+SO2+H2OH2SO4+2NH3→(NH4)2SO4蒸餾反應方程式：(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O吸收與滴定：2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl→2NH4Cl+4H3BO3食品分析與檢驗技術132．加快食品消化反應（1）硫酸鉀：硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加快有機物分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應溫度，反應方程式為：K2SO4+H2SO4→2KHSO42KHSO4→K2SO4十SO2↑十H2O（2）硫酸銅：起催化劑作用，使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物氧化，硫酸銅的作用機理如下所示：2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+O2↑C+CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+H2O+SO2↑

此反應不斷進行，待有機物全部被消化完后，不再有硫酸亞銅(褐色)生成，溶液呈現清澈的藍綠色，故硫酸銅除起催化劑的作用外，還可指示消化終點的到達。食品分析與檢驗技術14（三）不同食品的蛋白質換算系數食品種類F 食品種類 F小麥 5.83 小麥粉及其制品 大麥、燕麥、黑麥5.83 米 花生 5.46 大豆及其制品 畜禽肉及其制品6.25 乳及乳制品 芝麻、向日葵5.4 南瓜子 栗子、胡桃5.3 其他食品食品分析與檢驗技術15（四）注意事項1．蛋白質含量測定，因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂以及含氮色素等非蛋白質的含氮化合物，故結果稱為粗蛋白質含量。2．為減少實驗誤差，所有試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。3．消化過程要不斷轉動凱氏燒瓶，以利于附著在瓶壁上的固體殘渣洗下，促進其消化；同時為防止造成氮損失，不要用強火，應保持緩和沸騰。4．樣品中含脂肪或糖較多，消化過程中易產生大量泡沫，為防止泡沫外溢，在消化開始時用小火加熱，并時時搖動，也可以加入少量辛醇、液體石蠟或硅油消泡劑，并控制熱源強度。食品分析與檢驗技術165．一般消化至呈透明后，繼續消化30min即可,有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。6．當樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%過氧化氫2～3mL后繼續加熱消化。7．蒸餾裝置應該密封，防止漏氣，蒸餾過程中不得停火斷氣，防止發生倒吸；消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉淀，說明蒸餾前加堿量不足，要再增加氫氧化鈉用量；蒸餾完畢后，應先將冷凝管下端提高液面清洗管口，再蒸餾1min而后關掉熱源，否則可能造成吸收液倒吸。9．硼酸吸收液的溫度不應超過40℃，否則對氨的吸收作用減弱而造成損失，此時可置于冷水浴中。10．混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。食品分析與檢驗技術17五、測定食品中蛋白質的方法（一）食品中蛋白質的意義測定食品蛋白質的含量有利于評價食品的營養價值，合理開發利用食品資源，同時對于提高產品質量、優化食品配方具有重要意義食品分析與檢驗技術18食品蛋白質測定方法測定方法利用蛋白質的共性，即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質含量；利用蛋白質中特定的氨基酸殘基、酸性和堿性基團以及芳香基團等測定蛋白質含量。凱氏定氮法作為國家標準檢測蛋白質的方法，是目前最常用的方法，是測定總有機氮最準確和操作簡便的方法之一.雙縮脲法，染料結合法，紫外線吸收法，酚試劑法等采用紅外檢測儀對蛋白質進行快速定量分析。食品分析與檢驗技術19(二)雙縮脲法當脲被小心加熱至150～160℃時，兩分子間脫去一個氨分子形成雙縮脲，雙縮脲在堿性條件下，能與硫酸銅生成紫紅色配合物，稱為雙縮脲反應，由于蛋白質分子中有肽鍵(—CO—NH—)，與雙縮脲結構相似，故也能呈現此反應而生成紫紅色配合物，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質含量成正比，據此可用吸收光度法來測定蛋白質含量，該配合物的最大吸收波長為560nm。食品分析與檢驗技術201．標準曲線的繪制以采用凱氏定氮法測出蛋白質含量的樣品作為標準蛋白質樣品。按蛋白質含量40、50、60、70、80、90、100、110mg分別稱取混合均勻的標準蛋白質樣于8支50mL納氏比色管中，然后各加入1mL四氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液(①或②)準確稀釋至50mL，振搖10min，靜置1h，取上層清液離心5min(2000r/min)。取離心分離后的透明液于比色皿中，在560nm波長下以蒸餾水作參比液，調節儀器零點并測定各溶液的吸光度值以蛋白質的含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。食品分析與檢驗技術212．樣品的測定準確稱取樣品適量(即使得蛋白質含量在40～110mg)于50mL納氏比色管中，加1mL四氯化碳，按上述步驟顯色后，在相同條件下測其吸光度值。用測得的吸光度值在標準曲線上可查得蛋白質毫克數，由此求得蛋白質含量。食品分析與檢驗技術223．結果計算式中X——樣品蛋白質含量，mg/100g。m——由標準曲線上查得的蛋白質含量，mg；m1——樣品質量，g。4．試劑堿性硫酸銅溶液、氯化碳。5．儀器分光光度計、離心機。食品分析與檢驗技術236．注意事項（1）蛋白質的種類不同，對發色程度的影響不大。（2）標準曲線做完整之后，無需每次再做標準曲線。（3）含脂肪高的樣品應預先用醚脫脂。（4）樣品中有不溶性成分存在時，會給比色測定帶來困難，此時可預先將蛋白質抽出后再進行測定。（5）當肽鏈中含有脯氨酸時，若有多量糖類共存，顯色不好，測定值偏低。（6）本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領域中測定蛋白質含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種籽及肉類等樣品測定食品分析與檢驗技術24項目二：測定食品中氨基酸態氮一、案例二、選用國家標準醬油衛生標準的分析方法——甲醛值法。食品分析與檢驗技術25三、測定方法1．分析步驟（1）吸取醬油于100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋在至刻度，吸取混勻液于200mL燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉滴定至酸度計指示pH為，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液體積。（2）將燒杯中繼續加入10.0mL36%甲醛，混勻后用氫氧化鈉標準溶液繼續滴定至，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液體積。（3）做空白實驗，取實驗用水80mL，其余步驟同上，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液體積。食品分析與檢驗技術264．結果計算式中X——食品中氨基酸態氮的含量，g/100mL；V1——測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V2——試液空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V3——試樣稀釋液取用量，mL；c——氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；0.014——氮的毫摩爾質量，g/mmol。5．試劑36％甲醛溶液（不含聚合物）、氫氧化鈉標準滴定溶液。6．實驗儀器酸度計、磁力攪拌器、10mL微量滴定管。食品分析與檢驗技術27四、相關知識（一）食品中氨基酸態氮含量測定——甲醛值法原理（電位滴定法）利用氨基酸含有-COOH顯示酸性，又含有-NH2顯示堿性的兩性性質，當加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結合，固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，就可用氫氧化鈉標準溶液滴定-COOH，以間接方法測定氨基酸的量。本法摘自GB/TT5009.39-2003《醬油衛生標準的分析方法》,適用于食品中游離氨基酸含量的測定，是國家用于糧食和其副產品豆餅、麩皮等為原料釀造或配制醬油中氨基酸態氮分析方法。（二）注意事項1．氨基酸態氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量。對于醬油來說該指標越高，說明醬油中的氨基酸含量越高，鮮味越好。2．固體樣品要先進行粉碎，準確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液，萃取在50℃水浴中進行；液體樣品可以直接測定。食品分析與檢驗技術28五、測定食品中氨基酸態氮方法（一）食品中氨基酸態氮的意義氨基酸態氮是食品檢測一項重要指標，可以作為食品分級的依據，如醬油的等級。食品中氨基酸態氮測定的方法包括甲醛值法，比色法。甲醛值法除用電位滴定法進行操作外，還可以用指示劑法進行測定，用指示劑作為反應終點。食品分析與檢驗技術29（二）雙指示劑甲醛法指示劑分為單指示劑甲醛滴定法和雙指示劑甲醛滴定法，前者分析結果稍為偏低，后者更為準確，二者實驗原理同電位滴定法。1．移取含氨基酸約為20～30mg的樣品2份，分別置于250mL錐形瓶中，各加50mL蒸餾水，其中1份加入數滴1g/L中性紅乙醇指示劑，用標準溶液滴定至琥珀色為終點；另1份加入數滴1g/L百里酚酞乙醇指示劑及中性甲醛20mL，搖勻，靜置1min，用標準溶液滴定至淡藍色為終點。分別紀錄2次所消耗的NaOH標準溶液體積（mL）。食品分析與檢驗技術302．結果計算式中X——氨基酸態氮的質量分數，%；c——氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；V1——用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V2——用百里酚酞作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；m——測定用樣品溶液相當于樣品的質量，g；0.014——氮的毫摩爾質量，g/mmol。3．注意事項（1）此法中樣品顏色較深時，可加適量活性炭脫色后再測定。（2）單指示劑甲醛滴定法，只用百里酚酞指示劑。食品分析與檢驗技術31（三）比色法簡介在的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中，氨基酸態氮與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4二氫化吡啶氨基衍生物，在波長400nm處測定吸光度，與標準系列比較定量。食品分析與檢驗技術32項目三：測定食品中氨基酸一、案例二、選用的國家標準食品中氨基酸的測定——自動分析儀測定法。食品分析與檢驗技術33三、測定方法1．試樣處理試樣用勻漿機勻漿后在低溫冰箱中冷凍保存，需要時解凍使用。2．稱樣準確稱取勻漿好的試樣，試樣蛋白質含量在10～20mg范圍。3．水解在水解管中加入6mol/L鹽酸10～20mL，含水量高的試樣