農桿菌介導甘藍轉化實驗摘要：農桿菌是一種革蘭氏陰性細菌，能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，將外源DNA導入受體。本實驗主要材料是中甘十一號甘藍種子。該品種早熟豐產，冬性較強，并且早熟，適于我國華北、東北、西北及華南、中南、西南、華東等部分地區。用中甘十一號甘藍種子發芽，接入MS培養基制成無菌苗，超凈工作臺下取下胚軸和帶柄子葉，接入脫分化培養基獲得外植體。再利用LB固體培養基做平板劃線培養農桿菌，挑取單菌落在LB液體培養基培養至OD：0.3-0.6。將外植體在30ml加入了3ml農桿菌的MS0培養基浸泡，完成轉導。接回原培養基，7天后移入含500mg/L頭孢霉素的抑菌培養基。一星期后進行繼代培養，接入300mg/L頭孢霉素培養基，再進行結果檢測。Abstract:Agrobacteriumisagram-negativebacteria,inthenaturalconditionsbecomeinjuredpartsofinfectionmostdicotsandgymnosperms,exogenousDNAintoreceptor.Themainmaterialofthisexperimentisinthesweetelevencabbageseeds.Thevarietyoftheearlyharvest,winterisstrong,andpremature,suitableforpartsofNorthChina,northeast,northwestandsouthwest,South,SouthernChina,Eastchina.No.elevenseedgerminationofcabbagesweetuse,accesstoMSmediummadeofasepticseedlings,ultra-cleantablefromhypocotylandcotyledonwithpetioleexplantsdedifferentiation,gainaccessmedium.ThenusingLBsolidmediumplatestreakingcultivationofAgrobacterium,takingonecolonyculturemediumtoOD:0.3-0.6inliquidLB.Theexplantsin30mljoinedthe3mlofAgrobacteriumtumefaciensMS0mediumsoaking,completetransduction.Backtotheoriginalmedium,7daysintothetrichostatin500mg\/LcontainingCephalosporiummedium.Aweekafterthesubculture,access300mg\/Lcefotaximemedium,thenthetestresults.關鍵詞：甘藍轉基因外植體前言：甘藍近年來隨著國內周年供應需求及出口貿易的增加，出于甘藍產業發展的需要，甘藍遺傳育種的重要性日益凸顯，對遺傳育種目標提出許多新的要求。山一些新的病害如北方的枯萎病、南方的根腫病在生產上相繼出現，因而需要更多的抗病品種；過去甘藍生產主要需要春、秋兩季用品種，現在需要提供周年各季節生產和供應的品種；市場對商品品質的要求越來越高，為從根源上彌補甘藍的缺點，可將外源抗性基因導入。而農桿菌Ti質粒轉化與其他基因轉化體系相比，有很多優點。⑵首先Ti質粒轉化系統轉化的外源基因以單拷貝為多數，遺傳穩定性好，因此轉基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料。其次Ti質粒轉化系統操作比較容易，需要的儀器設備簡單，易于推廣，也解決了上訴問題。實驗方法：1.1選取100粒飽滿，無蟲害的中甘11號種子，在適當的溫度與濕度下保存。且2.1無菌苗的獲得2.11準備實驗：6個培養瓶，1瓶蒸餾水，報紙包好的小燒杯，高壓滅菌。按照MS培養基配方稱取大量元素（稀釋20倍）9ml，微量元素，鐵鹽，有機成分（稀釋200倍）分別稱取0.9ml。蔗糖30g/L5.4g，瓊脂粉7g/L1.26g。（按每瓶30ml計算）2.111熬制培養基，并不斷用玻璃棒攪拌，注意蔗糖開鍋后放，瓊脂預先加入冷水中。定容180ml，調PH5.8.用封口膜封好，滅菌冷卻。2.12打開超凈工作臺的紫外燈30分鐘，打開無菌風，將MS培養基分裝在6個滅菌的瓶子中待凝。點燃酒精燈，分別將鐵絲架，鑷子反復灼燒幾次備用。滅菌后的小燒杯放入100粒甘藍種子和無菌水，搖晃幾次，倒掉，再用0.1%的升汞消毒4分半，升汞回收。再用無菌水反復沖洗3次，接入MS培養基，每瓶15粒左右。（發芽率見表一）2.2外植體的獲取與預培養一周后，觀察六瓶苗生長良好，無染菌。打開超凈工作臺得無菌風，用烤好的鑷子剪下帶丙子葉與下胚軸1cm左右，獲得外植體。注意不要生長點。外植體的選擇最好在春夏，且幼嫩的組織或器官好于老化的組織和器官。2.21按照MS+4.5mg/L6-BA+0.01mg/LNAA（母液濃度分別為：）配置180ml。取6-BA0.8ml，NAA0.018ml，高溫滅菌，倒入六個滅菌的瓶子待凝。將外植體接入培養基，下胚軸平放，帶柄子葉葉面向上，斜插入培養基。一瓶十個左右。2.3農桿菌侵染與共培養2.31農桿菌是生活在植物根的表面依靠由根組織滲透出來的營養物質生存的一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌。能在自然條件下趨化性地感染140多種雙子葉植物或裸子植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤。農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。借助農桿菌實現的外源基因與整合，通過組織培養再生出轉基因植株。按照LB培養基，PH7.0，蛋白胨10g/L2g.酵母粉5g/L，1g。Nacl10g/L2g，制成200ml液體LB培養基。取50ml裝入三角瓶封口，其余加入瓊脂10g/L1.5g，制成150ml固體LB培養基。滅菌備用。并將一個空培養皿放三張濾紙和一個燒杯一起滅菌。2.32打開超凈工作臺，將固體LB培養基倒平板，凝固后用接種環取農桿菌劃線。恒溫培養2天。2.33觀察劃線狀態，有許多1mm圓形單菌落。用牙簽挑取一個單菌落，斜放入液體LB培養基搖床培養，28度18小時，并做一空白對照。18小時后觀察到和空白相比，培養基微微渾濁，測得OD值在0.3-0.6最佳。剩余菌滅活后再倒掉。2.34按照MS培養基配方制備30mlMS0培養基，用移液器吸取3ml菌液放入無菌燒杯，與培養基混勻。六瓶外植體放入燒杯中浸泡5分鐘，在用烤好得鑷子夾取，放入濾紙皿，再接回原培養基。2.4抑菌2.41由于外植體長期與農桿菌共同培養，會造成外植體死亡，所以在一周后加入抑菌劑頭孢霉素。由于頭孢霉素耐高溫能力較差，⑷所以后加。按照按照MS+4.5mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+頭孢霉素500mg/L制備抑菌培養基。配置50mlMS0培養基（終濃度為250mg/L）加入頭孢霉素0.0625ml,。180mlMS培養基（終濃度500mg/L）加入頭孢霉素0.45ml.滅菌備用。2.42打開超凈工作臺，在抑菌培養基不燙手時，加入頭孢。固體培養基倒入6個空瓶待凝。2.43用鑷子取外植體，用無菌水沖3次，在加入頭孢霉素得MS0培養基浸泡5分鐘，接入抑菌培養基，MS0滅貨倒掉。2.5繼代培養外植體移入MS+4.5mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+頭孢霉素300mg/L制備抑菌培養基.（各步驟染菌率見表二）2.6抗性植株的獲得在超凈工作臺，將外植體分化的抗性芽切下，接入生根培養基。注意無菌培養。2.7轉基因植物的檢測取一定量待測DNA樣品，用限制性內切酶酶切。進行電泳，EB染色。凝膠浸泡在適量變性液中，放置一小時。互用濾紙剪裁成與膠同樣大小，浸入buffer中平衡30分鐘。虹吸12小時。固定DNA，再進行預雜交，雜交。進行顯色反映。結論與討論：進行多次梯度實驗，可知種子消毒4分半的效果是最佳的。表一：瓶號123456發牙數101212101213接入量151614141517發芽率67%75%86%71%80%76%表二瓶號123456外植體培養666666抑菌666666繼代666665染菌數000001染菌率0000017%參考文獻：劉海坤，衛志明.利用根癌農桿菌介導轉化甘藍成熟種子胚尖獲得轉基因植株[J].植物生理與分子生物學學報，2004,30(6):631—636李海燕，劉淼.甘藍轉化過程中的褐化現象研究[J].作物雜志，2010,(1):33