熒光素&流式細胞術

楊培2014.02.11熒光素&流式技術.熒光素介紹流式細胞術基本原理

流式細胞術的應用

流式胞內因子的流式檢測流式多色Panel設計主要內容熒光素&流式技術.

一.熒光素介紹熒光素&流式技術.熒光素（Fluorescein）是具有光致熒光特性的染料，熒光染料種類很多。熒光染料泛指吸收某一波長的光波后能發射出另一波長大于吸收光的光波的物質。它們大多是含有苯環或雜環并帶有共軛雙鍵的化合物。熒光素介紹熒光素&流式技術.熒光素&流式技術.熒光素的激發和發射光譜任何發熒光的物質分子都具有這兩個特征光譜（nm）激發光譜（Excitation，Ex）：是指能特異性地激發某種熒光素的一定波長范圍內的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max發射光譜（Emission）：是指某一波長激發光引起熒光素發射的一定波長范圍內的熒光發射波峰（最大發射波長）：Em-Max熒光素的使用：選擇正確的激光器確定所需熒光探測器（PMT）488nm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素介紹熒光素&流式技術.Blue（488nm）FITCAlexaFluor488PEPerCPPerCP-Cy5.5PE-Cy5PE-Cy7PI7-AADRed（633nm）APCAPC-Cy7AF647AF700Violet（405nm）AmCyanBrilliantViolet421PacificBlueBrilliantViolet510BrilliantViolet570BrilliantViolet605BrilliantViolet650BrilliantViolet711BrilliantViolet785Qdot605UV(360nm）DAPI常用熒光素熒光素介紹熒光素&流式技術.第二步：熒光素的選擇熒光素光譜分析網絡工具：熒光素&流式技術.熒光素介紹熒光素&流式技術.熒光素&流式技術.Alexa488Alexa488合成的有機物AlexaFluors,Cydyes,Horizon,Dylight,etc蛋白

PE,APC,GFP,mCherry半導體納米

Qdots,Crystalplex,eFluorNC有機聚合物BrilliantVioletAlexa488PECy5Cy5Cy5熒光素家族熒光素&流式技術.CollisionalQuenching熒光素淬滅熒光素&流式技術.耦合熒光素熒光素&流式技術.耦合熒光素anti-MouseCD3e,clone145-2C11-PE/Cy5BioLegendCompetitor1

耦合熒光素不同廠家，抗體熒光強度不同：F:P值不同耦合熒光素對光、對固定劑更敏感熒光素&流式技術.BrilliantVioletTM570BrilliantVioletTM605BrilliantVioletTM650BrilliantVioletTM711BrilliantVioletTM785耦合熒光素家族PE-Cy7熒光素&流式技術.

BrilliantViolentTM簡稱“BV”，是諾貝爾獎獲得者發明的“最新一代”的熒光染料，“BV”染料是有機聚合物，它有很強的光吸收能力（消光系數）和光轉換能力（量子產率），這些物理特性使“BV”的亮度很強，更適合弱表達蛋白的檢測。BrilliantViolentTM熒光素家族，包括：BV421，BV510,BV570，BV605，BV650，BV711，BV785七個成員，充分利用流式細胞儀405nm激發管，與其它各種熒光素兼容性好。Biolegend公司可以提供最新最全的BV系列熒光抗體，BD目前只推出了四種！BrilliantVioletTM熒光素家族熒光素&流式技術.熒光素熒光強度激發光濾光片平行熒光素BrilliantVioletTM4215405nm 450/50PacificBlue

BrilliantVioletTM5104405nm510/50或525/50BDHorizon?V500和AmCyanBrilliantVioletTM5703405nm585/40PacificOrangeBrilliantVioletTM6055405nm605/12或510/20eFluor?605 和Qdot?605BrilliantVioletTM6504405nm660/20eFluor?650和Qdot?650BrilliantVioletTM7114405nm710/50eFluor?700NC和Qdot?705BrilliantVioletTM7853405nm780/60Qdot?800熒光素&流式技術.熒光強度。（檢測靈敏度及聯接蛋白數量）吸收光譜寬窄。（多色染色時不易漏光）光穩定性。（光漂白）Buffer穩定性。（PH值穩定）機器兼容性。（激發光與接收光是否與大眾化的機器相匹配）熒光素評價指標熒光素&流式技術.發射波長(nm)530 580 630680730780FITCPEPE-TRPE-CY5不同熒光素發射波長及波長寬窄不同熒光素評價指標--熒光發射波長熒光素&流式技術.熒光素評價指標--熒光強弱熒光素&流式技術.

二.流式細胞術基本原理熒光素&流式技術.流式細胞術（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種以流式細胞儀為檢測手段，可以快速、準確、客觀，同時檢測單個生物微粒的多項特性，并加以定量的技術，同時可以對特定群體加以分選。

特點:研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、人工合成微球等快速、準確、高通量檢測

多參數、多色熒光分析，對細胞特性的識別、計數更為準確定性或定量分析細胞分選特定性狀或功能的細胞流式細胞術原理熒光素&流式技術.液流系統光學系統電子系統分選系統流式細胞儀的基本結構熒光素&流式技術.流式細胞儀-光學系統熒光素&流式技術.熒光素&流式技術.前向角散射光（FSC）：反映相對大小側向角散射光（SSC）：反映細胞粒度及細胞內相對復雜性前向角檢測器

FSCLaser測向角檢測器

sSC激光光源信號檢測—散射光信號熒光素&流式技術.外周全血細胞散射光雙參數點圖

（紅細胞溶解后）白細胞淋巴細胞單核細胞

粒細胞

根據散射光信號從人白細胞中鑒別出不同亞群：熒光素&流式技術.信號檢測—

熒光素熒光信號熒光素&流式技術.CD3-FITCCD19-PEPI-Fluorescence#Evnts正常G0/G1期細胞直方圖(Histogram)二維點圖(DotPlot)三維圖（3DPlot）等

直方圖(Histogram)二維點圖(DotPlot)凋亡細胞峰

等高線圖(ContourPlot)密度圖(Density)流式數據三維圖（3DPlot）熒光素&流式技術.流式細胞術常用分析軟件BDcellquestBDFacsDiva。。。儀器自帶分析軟件第三方分析軟件熒光素&流式技術.三.流式細胞術的應用熒光素&流式技術.流式技術的應用熒光素&流式技術.流式技術的應用熒光素&流式技術.流式檢測技術：了解細胞的特征細胞亞群細胞表型細胞粘附分子細胞因子受體細胞胞內因子細胞周期熒光素&流式技術.四.流式胞內因子的流式檢測熒光素&流式技術.胞內檢測(ICFCorICS)?胞內檢測指標主要包括：細胞因子—胞漿轉錄因子—細胞核細胞內抗原或細胞內結構標志物信號分子,如：活化的蛋白激酶熒光素&流式技術.胞內流式檢測操作表面指標檢測固定/破膜胞內指標檢測活化細胞細胞因子阻斷熒光素&流式技術.5.201.81

37.53.921.0360.8IL-17IFN-γ熒光素&流式技術.流式細胞因子檢測檢測的細胞：是否分泌目標細胞因子

適合的細胞活化方法分泌細胞因子的阻斷：阻斷劑的添加與選擇固定，破膜：固定/破膜試劑的選擇盡量選擇強熒光素抗體檢測死細胞的去除細胞因子流式檢測，需要考慮的因素：熒光素&流式技術.細胞活化細胞活化的一般方法：PMA/Ionomycin,PHA/ConA

模擬體內活化方法：

MHC

(抗原),TCR(CD3±CD28),細胞因子(IL-2,IFN-r)，LPS細胞活化的protocols：熒光素&流式技術.分泌細胞因子的阻斷細胞因子表達后快速分泌，如果不進行阻斷，則細胞內因子含量很低，無法檢測.

阻斷劑包括:

BrefeldinA(#420601) Monensin(#420701)阻斷劑對細胞有一定毒性，與細胞接觸的時間越短越好(2-24h)。+BrefeldinA+Monensin熒光素&流式技術.細胞的固定與破膜固定: 多聚甲醛(PFA)濃度,時間,溫度(例如.2%PFA,4C,10-15min)

與熒光素，細胞表面指標兼容

終止液

：stainingbuffer+BSABioLegendFixationBuffer(#420801)

破膜: 皂素(0.05-0.2%)

其他破膜劑(MeOH,Tween20,TritonX-100)后續步驟都需要破膜劑:

洗滌步驟

抗體孵育BioLegendPermeabilizationWashBuffer(#421002)胞內因子與細胞核內指標檢測，需選擇不同的固定破膜劑??！熒光素&流式技術.核內指標染色:FoxP3TReg細胞鑒定：CD4+CD25+

FoxP3+BALB/cmousesplenocytesstainedwithMouseTregFlow?Kit(FOXP3AlexaFluor?488/CD4APC/CD25PE)核內指標檢測，需要破雙層膜，固定/破膜劑不同于胞內指標使用的試劑！FOXP3Fix/PermBuffer(4x)(#421401)FOXP3PermBuffer(10x)(#421402)熒光素&流式技術.如何節約您的時間？胞內檢測流程: 需要大約1天表面指標檢測固定/破膜胞內指標檢測刺激活化細胞活化固定破膜檢測

表面+胞內指標

室溫孵育抗體優于4°C檢測指標下調如：CD4BioLegendFixationbuffer(#420801)Cyto-LastBuffer(#422501)4°C可保存至2周哪些步驟可以保存及暫停實驗？

熒光素&流式技術.固定/破膜后染色檢測需注意！固定/破膜對表面指標的影響：Krutziketal.JI2005熒光素&流式技術.五.流式多色Panel設計熒光素&流式技術.帶有不同熒光素的細胞細胞表面受體針對細胞不同蛋白的標記不同熒光素單克隆抗體細胞與多種抗體共孵育流式多色檢測概述1.

1.多個激發光，濾光片，PMT2.選擇多種流式試劑熒光素&流式技術.

更加準確區分某一特定細胞群多種參數，獲得更多信息省時，省錢，省標本有助于發更好的文章流式多色檢測的優勢Th1隨著科學的發展，細胞的標記在不斷發現，數量在不斷增加！所以在區分某一特定細胞群時,需要更多的細胞標記。熒光素&流式技術.需要功能強大的流式細胞儀熒光素選擇更加困難補償難調節流式多色檢測的難點熒光素&流式技術.流式多色Panel設計第一步：了解您的流式儀器配置

型號,激發光，探測器，濾光片第二步：熒光素與流式儀器相匹配第三步：檢測指標與熒光素相匹配第四步：

查找&訂購商業的熒光素抗體

熒光素&流式技術.流式細胞儀主要廠商之一，分析分選均有，型號眾多，科研臨床領域都涉及流式細胞儀主要廠商之一，分析分選均有，型號眾多，科研臨床領域都涉及分析型流式，科研臨床領域都涉及分析型流式，有幾種型號，臨床領域為主Attune分析型流式，科研領域為主分析型流式，科研領域為主第一步：了解您的流式儀器配置熒光素&流式技術.FACSCalibur單激光三色，或雙激光四色，市場覆蓋率最高，分析型FACSCanto雙激光六色，分析型FACSAria雙激光六色，或三激光八色，分選型為主，也可以分析FACSLSR雙激光六色，三激光八色，或者更多激光，分析型最高配FACSInflux激光多個，高端分選型BD流式細胞儀熒光素&流式技術.CantoⅡandARIAtypical光路圖488nm405nm633nm熒光素&流式技術.檢測器組（激光器）PMT位置長通透鏡帶通/長通透鏡適用染料八角形A735780/60

PE-Cy7（488nm藍色激光）B655670LPPerCP-Cy5.5PerCPC610空白可選框-

D556585/42PEE502530/30FITCF空白可選框488/10SSCG空白可選框空白可選框-

H空白可選框空白可選框-

三角形A502510/50Amcyan,BV510（405nm)紫色激光）B空白540/50

PacificBlue,BV421三角形A735780/60

APC-Cy7（633nm紅色激光）B685空白可選框

C空白660/20

APCBDCantoⅡ光路參數例如：熒光素&流式技術.檢測器組（激光器）PMT位置長通透鏡帶通/長通透鏡適用染料八角形A735780/60

PE-Cy7（488nm藍色激光）B655670LPPerCP-Cy5.5PerCPC610空白可選框-

D556585/42PEE502530/30FITCF空白可選框488/10SSCG空白可選框空白可選框-

H空白可選框空白可選框-

三角形A502510/50Amcyan,BV510（405nm)紫色激光）B空白450/50

PacificBlue,BV421三角形A735780/60

APC-Cy7（633nm紅色激光）B685空白可選框

C空白660/20

APCBDCantoⅡ光路參數第二步：熒光素與流式儀器相匹配熒光素&流式技術.通常根據抗原的表達情況，可將其分為三大類：一類抗原：此類抗原高表達，且平行Panel中表達量變化不大.

如：CD3,CD4,CD8,CD56,CD11c等，通常選擇弱熒光素：PacificBlue,APC-Cy7,AlexaFluor700,BV785等

二類抗原：這類抗原是表型分型所必須的，平行Panel中表達量是變化的，如：活化的抗原，細胞因子等，通常選擇中強熒光素：如：BV510，BV650，FITC,PerCP-Cy5.5，BV570等三類抗原：抗原表達量非常低，或是我們根本不知道的抗原表達情況，而且通常僅能找到純化抗體或是有限的幾種熒光素標記。通常選擇最強的熒光素：BV421，PE，APC,BV605，AlexaFluor647等第三步：檢測抗原與熒光素相匹配例如：Th1/Th2/Th17/Treg檢測CD3，CD4；IFN-r，Foxp3；CD25，IL-4,IL-17A熒光素&流式技術.強表達抗原，選弱熒光素，也可選擇強熒光素弱表達抗原，一定要選強熒光素常用的熒光素強度1.弱表達抗原，一定選擇最強的熒光素；如果您對所檢測的抗原表達量不清楚，

對于Panel內重要的抗原選擇最強的熒光素；

熒光素&流式技術.熒光素&流式技術.人免疫細胞表面常用Marker的表達量熒光素&流式技術.熒光素亮度檢測抗原表達量背景優先使用頻率BV4215最低

最高PacificBlue1中到高

高FITC/AF4883低到中滲出到PE高APC/AF6475低到中

高BV5704中滲出到PE和BV421中Percp-Cy5.53中Crossbeam到AF700中PE5低到中

中AF7002中到高

中PE-Cy74低到中滲出到大部分PE的耦合熒光素

及Crossbeam到APC-Cy7中到低V5001很高

低PE-Cy55低Crossbeam到APC和

滲出到PE和Percp-Cy5.5低APC-Cy72中滲出到APC低PacificOrange1很高

很低PE-TR2中滲出到PE和PE-Cy5很低熒光素亮度不是選擇的唯一標準熒光素&流式技術.熒光素熒光強度BV4215PE5APC5BV5104PE-Cy74Percp-Cy5.53FITC3APC-Cy72BDCantoⅡ8色

耦合熒光素：如：Percp-Cy5.5,PE-Cy7，APC-Cy7等，對光及固定劑穩定性差：—Percp-Cy5.5對乙醇固定敏感—APC-Cy7對多聚甲醛固定敏感—耦合熒光素固定后，光譜可能發生改變2.FITC對較低的PH敏感3.APC&PE不能凍存例如：熒光素&流式技術.Th1/Th2/Th17/Treg檢測例如：儀器：BDCantoⅡ

檢測器組（激光器）長通透鏡帶通/長通透鏡適用染料八角形735780/60

PE-Cy7（488nm藍色激光）655670LPPerCP-Cy5.5PerCP610空白可選框-

556585/42PE502530/30FITC空白可選框488/10SSC空白可選框空白可選框-

空白可選框空白可選框-

三角形502510/50Amcyan,BV510（405nm)紫色激光）空白450/50

PacificBlue,BV421三角形735780/60

APC-Cy7（633nm紅色激光）685空白可選框

空白660/20

APC檢測指標：CD3，CD4，IFN-r，IL-4Foxp3，CD25，IL-17APanel：IndexFluoresceinCD3BV510CD4PerCP/Cy5.5CD25BV421FoxP3AF647IL-4PE-Cy7IFN-rFITCIL-17APELive/deadZombieNIR?FixableViabilityKit熒光素&流式技術.10colorfullpanelexample指標熒光素CD3AF700CD4PE-Cy5CD8Qdot605CD45RAPE-Cy7CD45ROAF488IL-4PEIFNgBV570IL-2APCIL-17aBV421熒光素&流式技術.第四步：

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非特異熒光信號的排除熒光素&流式技術.去除死細胞的干擾

死細胞因細胞膜已失去完整性，所以很容易與抗體結合，造成非常強的非特異性染色。一般來說，當細胞標本中的死細胞數目超過5%時，需重新采集標本，或使用“死細胞排除試劑盒”來排除死細胞的干擾。

實驗計劃試劑選擇（死活細胞檢測）進行活細胞檢測，無需細胞固定（如細胞分選）PI,或者7-AAD,或者ZombieAqua?，ZombieNIR?,ZombieYellow?先固定細胞，在進行流式抗體染色ZombieAqua?，ZombieNIR?,

ZombieYellow?先進行流式抗體染色，再固定細胞ZombieAqua?，ZombieNIR?,

ZombieYellow?做胞內流式檢測ZombieAqua?，ZombieNIR?,

ZombieYellow?熒光素&流式技術.TruStainFcX(anti-mouseCD16/32),#101319humanTruStainFcX,#422301去除非特異熒光信號—FcR封閉如：單核細胞，B細胞，DC細胞，NK，巨噬細胞，粒細胞，腫瘤細胞等高表達FcR，在檢測這些細胞時，會出現假陽性或假陰性的結果：熒光素&流式技術.樣本管加入正常抗體同型對照加入同型抗體陰性對照加PBS抗體FC段非特異性結合位點（普遍存在）檢測抗原位點熒光組成1、細胞自發熒光2、非特異性標記熒光3、特異性標記熒光熒光組成1、細胞自發熒光2、非特異性標記熒光熒光組成1、細胞自發熒光對照的設置熒光素&流式技術.同型對照

為什么要設同型對照?用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面的Fc受體及靜電結

合而產生的背景染色.

如何選擇同型對照?

與實驗染色的單克隆抗體特異性無關的免疫球蛋白亞型

與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標記④相同劑量和濃度例如:標記FITC的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標記PE的單克隆抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應選