農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸概述蛋白質是生命的物質基礎，蛋白質的含量是衡量農產品品質的重要指標。測定蛋白質的方法很多，可分為兩大類。一類是間接法，即定氮法。定氮法測定的蛋白質含有氨基酸等非蛋白氮，稱“粗蛋白質”。二類是直接法。將蛋白質沉淀分離以后，進行全氮測定后換算成蛋白質含量。或者直接測定蛋白質農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.1蛋白質的測定4.1.1粗蛋白質的測定

4.1.1.1開氏定氮法(GB5009.5-85)常量：新鮮的魚、肉、氮及含硝態氮較多的蔬菜半微量：植物（秸稈、種子）和動物飼料農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

原理：樣品用濃硫酸和加速劑（K2SO4-CuSO4-Se）消煮分解，使其中所含的有機氮化合物轉變為氨，并形成(NH4)2SO4;加堿蒸餾，用H3BO3吸收NH3。然后用標準酸滴定。計算含氮量，換算成蛋白質含量。H2NCH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3(l)2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3(3)農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸注意1：開氏定氮法靈敏度低,適用于0.2-1.0mg氮,誤差為2%,費時8-10小時,將氮轉化為氨,用酸吸收后滴定.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸注意2：氮-蛋白質換算系數

產品名稱系數產品名稱系數畜產品蛋品6.25小豆6.25肉類6.25蓖麻5.3牛奶6.38大豆5.71谷類稻米5.95刀豆菜豆綠豆豌豆6.25大麥黑麥谷子燕麥5.83玉米6.25堅果杏仁5.18蕎麥6.25巴西果5.46灰胡桃5.30小麥整粒5.83椰子仁糠6.31美洲山核桃胚芽5.8種子甜瓜子5.30胚乳5.7棉籽芝麻等系數是以蛋白質平均含氮量推導出來。比如16%->6.25農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸如果樣品中含有一定量的硝態氮，由于開氏法分解時也會導致其中的硝態氮化合物氨化率為50-80%。使蛋白質測定產生誤差。特別是葉菜類。解決方法：用電極法測定硝態氮，然后減去開氏法全氮。注意3：農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.1.1.2水楊酸比色法原理：樣品中的蛋白質經硫酸消化轉化為銨鹽后，在一定酸度和溫度下與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成有色化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品的含氮量，計算蛋白質含量。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸NH4-N的測定試劑：1.檸檬酸鹽（citrate）2.salicylate-nitroprusside(硝普鈉，亞硝基鐵氰化合物)goodfor4weeks3.hypochlorite(次氯酸鹽).Madeeveryday農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸NO3-N的測定試劑：1Devarda’salloy（Devarda’sAlloycontainsaluminum,zincandcopper.）20.2MH2SO4農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.1.2(純)蛋白質測定

（直接法）這類方法根據蛋白質的理化性質來測定蛋白質。有染料結合法，雙縮脲法，紫外法，熒光法等。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

常用的有四個方法：(1)theprotein'sintrinsicUVabsorbance

蛋白質特征紫外吸收法(2)BiuretProteinAssay

雙縮脲法

(3)theLowryassayLowry法

(4)theBradforddyeassay.

染料結合法農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

Althoughoneormorethesemethodsisusedroutinelyinalmosteverybiochemicallaboratory,noneoftheproceduresareparticularlyconvenientforvariousreasons.各個方法均有優缺點。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.1.2.1雙縮脲法

[原理]

雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反應生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應。在一定范圍內，其顏色的深淺與蛋白質濃度成正比。因此，可以利用比色法測定蛋白質濃度。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

雙縮脲法（BiuretProteinAssay）是測定蛋白質濃度的常用方法之一。操作簡便、迅速、受蛋白質種類性質的影響較小，但靈敏度較差，而且特異性不高。除-CONH-有此反應外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基團也有此反應。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

測定范圍為1~10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。該法多用于谷類種子測定。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸試劑（1）標準蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（BovineSerumAlbumin,BSA）或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液。如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配制成標準蛋白質溶液。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

（2）雙縮脲試劑：稱以克硫酸銅（CuSO4?5H2O）和克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現，則需要重新配制。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.1.2.2

LOWRYPROTEINASSAY

TheLowryprocedureisoneofthemostvenerableandwidely-usedproteinassays,beingfirstdescribedin1951.[Lowryetal.,Usingbovineserumalbuminasstandardmeasurementwithfolinphenolreagent.J.Biol.Chem.193:265-275(1951)].

.Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸實驗原理蛋白質含有兩個以上的肽鍵(—CO—NH—)，因此有雙縮脲反應，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡合物。Folin酚反應是在雙縮脲反應的基礎上，引進Folin試劑(磷鉬酸—磷鎢酸試劑)，蛋白質—銅絡合物能還原磷鉬酸—磷鎢酸試劑，生成藍色物質。在一定條件下，藍色強度與蛋白質的量成正比例。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

Underalkalineconditions,coppercomplexeswithprotein.Whenfolinphenolreagent(phospho-molybdic-phosphotungsticreagent)isadded,theFolin-phenolreagentbindstotheprotein.Boundreagentisslowlyreducedandchangescolorfromyellowtoblue農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

本法的優點是操作簡便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏10—20倍，較雙縮脲法靈敏100倍。缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

進行測定時，加Folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發生，故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。

農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。

此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸StockSolutions

儲備液

LowryA:2%Na2CO3in0.1MNaOHLowryB:1%CuSO4indiH2OLowryC:2%sodiumpotassiumtartrate(NaKC4H4O6?4H2O)農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸Reagents

Lowrystockreagent

49mlLowryA

0.5mlLowryB

0.5mlLowryCFolin'sReagent:Phenolreagent-2N(Folin-Ciocalteaureagent).Dilute1:1indiH2Obeforeuse.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

Standard:Bovineserumalbumin(BSA)Thestandardshouldbedissolvedataconcentrationof1mg/mlinabuffersimilartothesolutiontheunknownisin(usePBSforbiologicalsamples)anddilutedasfollows:農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

microgramsproteinstandardmicrolitersstandardmicrolitersbuffer001001010902020803030705050507575251001000Phosphatebufferedsaline(PBS,20mMsodiumphosphate,150mMNaCl,pH8.0)農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸Procedure1)Add100ulofsample(sample+buffer=100ul)pertube.每管加入100ul樣品溶液2)Add1.0mlofLowrystockreagenttoeachtube.每管加1mlLowry儲存液；3)Incubate10minatroomtemperature.在室溫下培養10min4)Add100ulofFolin‘sreagenttoeachtube.每管加100ulFolin試劑5)Incubate30minatroomtemperature.在室溫下培養30min6)Readinaspectrophotometerat595nm.在595nm處比色農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.1.2.3BCA（Bicinchoninicacid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉）法農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

amodificationoftheLowryprocedureexistsbasedonuseofbicinchoninicacid(BCA)inplaceoftheFolin-phenolreagent

[Smithetal.,AnalBiochem.150,76-85(1985)].

Because：TheBCAislesspronetointerferencethantheLowryprocedureandismoresensitive.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸特點準確靈敏：BCA試劑的蛋白質測定范圍是20－2000μg/ml；MicroBCA試劑測定范圍是快速：45分鐘內完成測定，比經典的Lowry法快4倍而且更加方便經濟實用：除試管外，測定可在微孔板中進行，大大節約樣品和試劑用量不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響檢測不同蛋白質分子的變異系數小于考馬斯亮藍農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

基本原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸BCA蛋白質檢測流程：

農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.1.2.4染料結合法原理：蛋白質中的堿性氨基酸（賴氨酸，精氨酸，組氨酸）和蛋白質的末端自由基在pH2-3的酸性緩沖液中呈陽離子狀態，可與偶氮璜酸染料類物質如桔黃G、酸性橙12等陰離子結合，形成不溶于水的蛋白質-染料絡合物而沉淀。由于染料結合量與蛋白質含量有很好的正相關，因此，可以通過測定染料結合量計算樣品的蛋白質含量。該法簡單快速，適于大批樣品的篩選工作。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸考馬斯亮藍染色法測定蛋白質濃度

馬斯亮藍G-20染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料最大吸收峰位置,由465nm變為595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色.染料主要是與蛋白質中堿性氨基酸和芳香氨基酸殘基結合.考馬斯亮藍在一定蛋白質濃度范圍內，蛋白質和染料結合符合比爾定律，因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結合的蛋白質量。該法簡單、迅速、干擾物質少、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸CoomassieDye-Based蛋白質定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

TheBradfordproteinassayisasimpleprocedurefordeterminationofproteinconcentrationsinsolutionsthatdependsuponthechangeinabsorbanceinCoomassieBlueG-250uponbindingofproteinBradford,M.,Arapidandsensitivemethodforthequantitionofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofdye-binding.Anal.Biochem.72,248-254,(1976)農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

Unlikemanyotherassays,includingtheLowryprocedure,theBradfordassayisnotsusceptibletointerferencebyawidevarietyofchemicalspresentinsamples.Thenotableexceptionishighconcentrationsofdetergents.Thereissignificantprotein-to-proteinvariationinabsorbancevaluesobtainedwiththeBradfordprocedureanditisadvisabletochooseaproteinstandardthatislikelytogiveabsorbancevaluesclosetothosefortheproteinsamplesofinterest.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

Bradford法的突出特點:(1)靈敏度高.其最低檢測蛋白質含量可達1mg,這是因為蛋白質與染料相結合后產生的顏色變化很大,蛋白質-染料復合物有更高的吸光系數,因而光吸收要比Folin–酚試劑法大得多.(2)測定快速,簡潔,只需要加一種試劑.完成一個樣品的測定,只要5分鐘左右.由于染料與蛋白質結合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時內保持穩定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩定性最好.(3).干擾物質少.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸此法缺點:(1).由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford

法用于不同蛋白質時有較大的偏差.(2).仍有一些物質干擾此法的測定,主要的干擾物質有去污劑等(3).標準曲線也有輕微的非線形,因而不能用比爾定律進行計算而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸(二)試劑與器材1.試劑:(1)標準蛋白質溶液,用G-蛋白或牛血清蛋白,配制成和的標準蛋白質溶液.(2)考馬斯亮蘭G-250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭G-250,溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸,用水稀釋至1L農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸2.器材(1)可見光分光光度計(2)旋渦混合器(3)試管16支(三)操作方法1標準方法(1)取16支試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分為兩組,按表中順序,分別加入樣品,水和試劑,即用的標準蛋白質溶液給個試管分別加入:0,0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1ml,然后用水補充到最后各試管中分別加入考馬斯亮藍G-250試劑.未知樣品見表中的8,9,10管農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸(2)加完試劑2-5分鐘后,即可開始用比色皿,在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A595,空白對照為1號管.注意:不可用石英比色皿(因不易洗去染料)(3)用標準蛋白質(mg)為橫坐標,用吸光值A595為縱坐標,作圖,即得一標準曲線.由此標準曲線,根據測出的為止樣品A595值,即可查出樣品蛋白質含量牛血清蛋白/ml溶液約為0.50.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸管號

12345678910蛋白質（mg/ml）

00.010.020.040.060.080.100.020.040.06蒸餾水

0.10.090.080.060.040.020.000.080.060.04考馬斯亮蘭5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸注意事項（1）如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的5-20min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色最穩定。（2）測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，但此復合物的吸附量可以忽略。測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

BradfordReagent-sellsaready-to-usereagent(cat#500-0006)thatcanbestoredat4C.Alternatively,thereagentcanbemadebydissolving100mgCoomassieBlueG-250(availablefromseveralsources)in50ml95%ethanol,adding100ml85%(w/v)phosphoricacidtothissolutionanddilutingthemixtureto1literwithwater.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

Bovineserumalbumin(BSA)(1mg/ml)–dissolveBSAinsalineandstoreitfrozenin1mlaliquotsforquickuse.Thestandardshouldbedissolvedinabuffersimilartothattheunknownswillbedissolvedin.Note:otherstandardsareacceptableandmaybepreferredforcertainapplications(forexample,useanIgGstandardwhenmeasuringconcentrationsofimmunoglobulins.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

Procedure

Note:doalldeterminationsinduplicateortriplicate

1.Pipette0,2,4,6,10,15and20

μlofBSA(1mg/ml)intoassignedwellsofa96-wellplate.2.Pipetteupto20μlofunknownsamplesintoindividualwellsofa96-wellplate.3.Add40μlofBradfordReagentintoallwellscontainingstandardorsample.4.AdddiH2Otoallwellstobringthefinalvolumeto200μl.5.Readabsorbanceat595nmwithoutanypriorincubation.農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

RepresentativeStandardCurve

Notenon-linearityatlowendofthestandardcurve

農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸紫外分光光度法測定蛋白質濃度

[原理]

蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內吸收峰的光密度值與其濃度成正比關系，故可作為蛋白質定量測定的依據.4.1.2.5其它方法農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

但由于各種蛋白質的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要準確定量，必需要有待測蛋白質的純品作為標準來比較，或且已經知道其消光系數作為參考。另外，不少雜質在280nm波長下也有—定吸收能力，可能發生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同時存在核酸時，必須同時測定OD260nm，與OD280nm。然后根據兩種波長的吸收度的比值，通過經驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質的真實含量。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

本法操作簡便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化之蛋白質的微量測定。主要缺點：當待測的蛋白質與標準蛋白質中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時，則產生—定誤差，混有核酸時必須分別測定280nm和260nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質含量。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.1.2.6熒光法熒光染料亮磺化磺素與堿性氨基酸結合，生成的絡合物在430nm激發下產生波長為510nm的熒光。熒光的強度與蛋白質含量呈正比。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

氨基酸分離和鑒定

3.2.1.1氨基酸自動分析儀法

3.2.1.2HPLC法3.2.2谷物和飼料中賴氨酸的測定（FDNB法）3.2.3色氨酸的測定（熒光分析法）4.2氨基酸的測定農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸4.2氨基酸的測定氨基酸是蛋白質的基本單位，也是蛋白質的分解產物。生物體內的氨基酸以多種形式存在，但主要可分為兩種：構成蛋白質的氨基酸和游離氨基酸。農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

氨基酸的測定包括氨基酸總量測定和氨基酸單個測定。氨基酸總量的測定法：1）許多用于測定蛋白質全氮含量的方法，包括開氏法，也可以用于測定氨基酸。2）甲醛滴定法3）范司來克法4）茚三酮比色法5）薄層層析法6）色譜法7）氨基酸自動分析儀農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸氨基酸分離和鑒定4.2.1.1氨基酸自動分析儀法氨基酸分析儀的中心是離子交換層析柱，當流動相推動氨基酸流經裝有陽離子交換樹脂的色譜柱時，氨基酸與樹脂中的交換基團進行離子交換。當用不同的緩沖液進行洗脫時，因交換能力不同而將氨基酸混合物分開，氨基酸按順序流出。流出的氨基酸與茚三酮反應，顯色后的氨基酸由光度計檢測。

農產品中蘊含的蛋白質和氨基酸

4.2.1.2