淺論慢病毒介導靶向PRL【摘要】【目的】探討肝再生磷酸酶-3(PRL-3)的表達對肝癌細胞侵襲能力的影響。【方法】設計、合成4對針對PRL-3基因siRNA的寡核苷酸序列，分別構建質粒，轉染293T細胞，據其對PRL-3的抑制率，篩選最有效的PRL-3基因RNAi靶序列，設計并合成其siRNA的雙鏈DNAOligo，與含綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因的pGCL-GFP線性化載體連接產生重組慢病毒質粒LV-PRL3-SiRNA，并行PCR和測序鑒定。將LV-PRL3-SiRNA，pHelper和pHelper三種質粒DNA共轉染293T細胞，包裝產生慢病毒，以293T細胞GFP蛋白的表達水平經孔稀釋法測定病毒滴度。重組慢病毒感染肝癌SMCC7721細胞，行realtime-PCR和western-blot驗證PRL-3基因的沉默效果。用Transwell侵襲試驗檢測SMCC7721細胞體外侵襲力的改變。【結果】成功構建PRL-3基因RNA干擾慢病毒載體并獲得相應的慢病毒，濃縮病毒懸液的滴度為6×108Tu/mL。和對照組相比，RNA干擾組SMMC7721細胞PRL-3基因的mRNA水平和蛋白水平的抑制率分別為75%和63%;其穿過人工基底膜的平均數(±)明顯少于空白對照組(±)及非特異性siRNA感染組(±)，侵襲抑制率為58%(P)。【結論】降低PRL-3的表達可抑制肝癌細胞的侵襲能力。

【關鍵詞】RNA干擾;慢病毒;PRL-3;肝細胞癌

Abstract：【Objective】ToconstructrecombinantlentiviralvectorexpressingsiRNAtargetingPRL-3geneandexploreitsinfluenceoninvasivepotencyofinfectedhepatocellularcarcinomacelllineSMCC7721.【Methods】FoursequencesofsiRNAtargetingPRL-3geneweredesigned，ofwhichbothsenseandanti-senseDNAOligoweredesigned，synthesizedandcorrespondingplasmidswereconstructed.ThemosteffectivesequenceofsiRNAwasscreenedbyefficiencyofPRL-3geneknock-downintransfected293TcellsanditsDNAOligowasclonedintothepGCL-GFPvector，whichcontainedcodinggeneofgreenfluorescentprotein(GFP).TheresultingrecombinantlentiviralvectorexpressingsiRNAtargetingPRL-3genewascalledLV-PRL3-SiRNA，anditwasconfirmedbyPCRandDNAsequencing.293Tcellswereco-transfectedwithLV-PRL3-SiRNA，pHelperandpHelperandthelentiviruswasproduced.ThetiterofviruswastestedaccordingtotheexpressionlevelofGFPin293Tcells.SMCC7721cellswereinfectedwithrecombinantlentivirusandthesilencingeffectofPRL-3genewasassessedbyreal-timePCRandwestern-blot.TheinvasiveactivityofinfectedSMCC7721cellswasanalyzedbyTranswellinvasionassay.【Results】RecombinantlentiviralvectorexpressingsiRNAtargetingPRL-3genewassuccessfullyestablishedandconfirmedbyDNAsequencing.TherecombinantlentiviruswiththemosteffectivePRL-3geneknock-downwereharvestedfrom293Tcellswithaviraltiterof6×108Tu/mL.Resultsofreal-timePCRandWesternblotshowedthatcomparedwithcontrolgroup，PRL-3expressioninSMCC7721早期血行播散及術后復發(fā)是肝細胞癌(HCC)預后不良的主要原因[1]。關于HCC轉移復發(fā)的具體機制尚未完全明了，因此尋找與其惡性進展密切相關的分子標志物顯得意義重大。蛋白酪氨酸的磷酸化與去磷酸化分別受蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinases，PTKS)和蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatases，PTPs)的調節(jié)，是細胞生長、分化等生命活動的重要調節(jié)方式，這兩種酶的作用失衡可導致蛋白酪氨酸的磷酸化水平異常，從而引起癌癥等疾病的發(fā)生。PRL-3屬于PTP家族成員，近年研究發(fā)現它與人類多種惡性腫瘤的轉移復發(fā)及不良預后有關[3-5]。但PRL-3與HCC生物學行為間的關系尚未見報導。本研究通過慢病毒介導的RNA干擾技術抑制肝癌細胞中PRL-3的表達，觀察肝癌細胞體外侵襲能力的改變，探討PRL-3表達水平與肝細胞癌惡性生物學行為間的關系。

1材料和方法

材料

人肝癌細胞SMCC-7721、293T細胞及大腸桿菌DH5α由本院中心實驗室保存。慢病毒包裝系統(tǒng)由pGC-LV載體、pHelper載體和pHelper載體三質粒組成，購自吉凱公司，限制性內切酶AgeⅠ和EcoRⅠ、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及T4連接酶購自NewEnglandBiolabs(NEB)公司，PRL-3鼠抗人多克隆抗體(ab503276)及鼠抗人β-actin單克隆抗體(英國ABCAM公司)，HRP標記羊抗鼠二抗、BCA蛋白質定量試劑盒(美國PIERCE公司)，胎牛血清(美國GIBCO公司)，大量質粒DNA提取試劑盒購自Qiagen公司，細胞總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit(大連寶生物工程有限公司)，細胞可溶性總蛋白提取試劑盒(美國CST公司)，dNTP及RnaseInhibitor購自Promega公司。OligodT購自上海生工，RNase-free的物品都購自Axygen。Matrigel(BDPharmingen，Bedford，USA)，Transwellchambers(Corning，NY，USA)。

方法

構建表達shRNA慢病毒載體

選擇GeneBank中人PRL-3基因編碼區(qū)序列(NM-032611)作為分析序列。設計、合成4對針對PRL-3基因siRNA的寡核苷酸序列，使用BLAST(Basiclocalalignmentsearchtool)將選擇的干擾序列和相應的基因組數據(人、小鼠、大鼠等)進行序列比對，確信所選序列與其他的基因不具有同源性。分別構建各干擾序列的表達質粒，轉染293T細胞，據其對PRL-3基因的抑制率，確定最有效靶序列為：5′-GCTCACCTACCTGGAGAAA-3′，設計并合成(上海吉凱基因化學技術公司)其siRNA的DNAOligo：5′-CCGGCAGCTCACCTACCTGGAGAAATTCAAGAGATTTCTCCAGGTAGGTGAGCTGTTTTTG-3′。陰性對照的核心序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，以下稱為NC序列，其DNAOligo：5′-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT-3′。寡核苷酸經退火形成雙鏈DNA，經T4連接酶與AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的pGCL-GF線性化載體連接，形成表達shRNA的重組慢病毒質粒載體，并行酶切鑒定。用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞，轉化DH5ɑ大腸桿菌，挑取重組陽性克隆行PCR篩選，并作測序分析(上海吉凱基因化學技術有限公司)。PCR鑒定陽性克隆的引物：上游引物：5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′;下游引物：5′-GTAATACGGTTATCCACGCG-3′。

慢病毒包裝及滴度測定

以Qiagen公司的質粒抽提試劑盒對慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質粒即：表達最有效靶序列siRNA的重組慢病毒質粒載體pGC-LV，pHelper，及pHelper，分別進行高純度無內毒素DNA抽提，質粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質粒DNA的A260/A280在～之間。按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說明進行共轉染293T細胞，轉染后8h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，以293T細胞GFP蛋白的表達水平經孔稀釋法測定病毒滴度。

SMCC-7721細胞分組及感染

細胞分為3組：SMCC771-CON，空白對照組(CON)，未感染慢病毒的細胞;SMCC7721-NC，陰性對照組(NC)，即陰性對照慢病毒LV-PRL3-SiRNA-neg感染的細胞組;SMCC7721-KD，基因敲除組(KD)，被RNAi靶點病毒LV-PRL3-SiRNA感染的SMCC7721細胞。處于對數生長期的靶細胞進行胰酶消化，制成細胞懸液將細胞懸液(細胞數約為2×104)接種于12孔板中，℃，體積分數為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合度達到約30%，根據MOI值，按實驗設計的組別分別加入RNAi慢病毒顆粒進行目的細胞的感染實驗。待感染時間達到5d后收集細胞抽提RNA及蛋白分別進行RealtimePCR及westernblot檢測實驗，進而判斷靶點的干擾效果。

RealtimePCR收集

上述3組SMCC-7721細胞，用PBS洗3次，按照試劑盒操作手冊提取提總RNA，用紫外分光光度法定量RNA。將等量的RNA反轉錄為cDNA第1鏈。SYBRPrimeScriptRT-PCRKit(兩步法)反轉錄反應條件℃15min，℃5s。PRL-3上游引物：5′-GATGGCATCACCGTTGTGGA-3′，下游引物：5′-CGTACTTCATCCCGCTCTCAAT-3′，以β-actin基因為內對照，上游引物：5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，下游：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。將PCR反應液加入RealTimePCR用反應管中：℃15s，1個循環(huán);℃5s、℃30s，45個循環(huán)。定量的方法以2-ΔΔCt(Ct代表循環(huán)閾值)表示基因的表達量，以加陰性對照病毒LV-PRL3-SiRNA-neg感染的細胞為對照細胞，公式ΔΔCt=(Ct(targetgene)-Ct(β-actin))感染細胞-(Ct(targetgene)-Ct(β-actin))對照細胞，以上實驗重復3次。

Westernblot細胞收集后加入RIPA

裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF，冰上孵育30min，4℃14000×g，30min離心，將上清移至一新的EP管中，Bradford法測定蛋白質濃度，并分裝。取20μg蛋白質，與2×SDS上樣緩沖液1∶1混合，沸水煮10min，置冰上2min，行12%SDS電泳。電泳完畢后，PAGE膠上的蛋白質用Bio-Rad微型電轉移系統(tǒng)于4℃、100mA電轉移h至PVDF膜上。PVDF膜用20mL封閉液(含50g/L脫脂奶粉的TBST)室溫孵育1h，倒去封閉液，加入兔抗人PRL-3多克隆抗體(1：1000稀釋)4℃孵育過夜，25mLTBST洗膜3次，每次5min，加入HRP標記的抗兔二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，25mL×5min。膜稍滴干后加入化學發(fā)光試劑孵育1min，迅速用保鮮膜包好后置于暗盒內與KoDakX-膠片貼在一起曝光，曝光時間1min。X線膠片經顯影、定影后掃描記錄。以β-actin為內對照。以上實驗重復3次。

體外Transwell侵襲實驗

在每個Transwell小室的多聚碳酸酯膜(孔徑為8μm)上涂布35μg(50μL/孔)Matrigel，制成人工基底膜，并用PBS洗去多余的配體。各組SMCC-7721細胞用含5mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，胰酶消化并用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌兩次，然后用含5mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸成密度為×106/mL的細胞懸液。每個Transwell小室的上室加入mL這種細胞懸液(約×105個細胞)，下室加入mL含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。按常規(guī)培養(yǎng)72h，取出小室并丟棄上室液體，用棉簽仔細擦去膜上未侵襲的細胞及人工基底膜膠，以40g/L多聚甲醛液固定。Hematoxylinandeosin(HE)染色后，于顯微鏡下計數侵襲到膜下面的細胞。200倍光鏡隨機選擇5個視野計數，取平均值。

統(tǒng)計學方法

應用SPSS統(tǒng)計分析軟件，結果以均數±標準差(x±S)表示，兩個樣本均數比較應用t檢驗，多個樣本均數比較應用單因素方差分析，檢驗水準α=，P為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

PRL-3shRNA重組慢病毒載體PCR及DNA測序鑒定

PRL-3shRNA重組慢病毒載體質粒轉化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽性克隆行PCR鑒定。陽性重組細菌克隆的PCR產物343bp(從載體中切掉24bp)，以經雙酶切后沒有插入片段的pGC-L空載體PCR產物306bp為對照，鑒定結果與預期相符(圖1)。測序結果表明插入片段與設計的PRL-3shRNA核苷酸序列完全一致，未發(fā)現有突變、缺失、插入等異常存在，表明已經成功地構建PRL-3基因特異性siRNA的重組慢病毒載體并命名為LV-PRL3-siRNA(圖2)。作為陰性對照的PRL-3基因非特異性siRNA重組慢病毒載體并命名為LV-PRL3-siRNA-neg。

重組慢病毒滴度及SMCC7721細胞的感染

以293T細胞GFP蛋白的表達水平經孔稀釋法測得慢病毒濃縮液滴度為6×108Tu/mL，說明有大量質粒轉入293T細胞，病毒成功包裝。在復感指數MOI為20時，根據綠色熒光顯微鏡下能發(fā)出綠色熒光的細胞比例判斷，重組慢病毒對基因敲除組細胞(KD)及陰性對照組細胞(NC)感染率均在95%以上。空白對照組(CON)內未觀察到綠色熒光蛋白表達陽性的細胞(圖3)。

重組慢病毒感染SMCC7721細胞后PRL-3mRNA的表達

熒光定量PCR的結果顯示，基因敲除組細胞(KD)中PRL-3mRNA表達量僅為陰性對照組細胞(NC)的25%，即干擾率為75%，而陰性對照組與空白對照組細胞(CON)之間的PRL-3mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異(P)。說明與陰性對照病毒LV-PRL3-siRNA-neg相比，RNAi靶點病毒LV-PRL3-siRNA對SMMC7721細胞中PRL-3基因的表達有顯著敲減效果(P，圖4)。

重組慢病毒感染SMCC7721細胞后PRL-3蛋白的的表達

Westernblot結果與熒光定量PCR結果相一致，基因敲除組細胞(KD)中PRL-3蛋白表達量僅為陰性對照組細胞(NC)的%，即抑制率為%，而陰性對照組與空白對照組細胞(CON)之間的PRL-3蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異()。說明與陰性對照病毒LV-PRL3-siRNA-neg相比，RNAi靶點病毒LV-PRL3-siRNA對SMMC7721細胞中PRL-3基因的蛋白水平表達有顯著抑制效果(P，圖5)。

RNA干擾對SMCC-7721細胞侵襲能力的影響

PRL-3特異性siRNA感染的SMCC-7721細胞穿過人工基底膜的平均細胞數(，S=)明顯少于空白對照組(，S=)及非特異性siRNA感染組(，S=)，侵襲抑制率為58%，差異有統(tǒng)計學意義(P，圖6)。

3討論

Saha等首次發(fā)現PRL-3過表達與結直腸癌的轉移有關。他們用基因表達系列分析法(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)發(fā)現PRL-3在正常結直腸黏膜上皮不表達，在進展期結直腸癌組織中度表達，而在結直腸癌肝轉移灶中持續(xù)高度表達。后來的研究發(fā)現PRL-3過表達對胃癌淋巴結或腹膜轉移，以及乳腺癌的遠處淋巴結轉移均有獨立的預測價值。在卵巢癌中，PRL-3過表達與腫瘤轉移無關，但與其分期密切相關。Wu等發(fā)現PRL-3在肝癌組織中的表達明顯高于正常肝組織，但有關PRL-3表達水平對肝癌細胞生物學行為影響的研究尚未見報導。

PRL-3過表達與腫瘤轉移復發(fā)的關系在細胞水平也已得到驗證。Zeng等[10]最先證明PRL-3過表達能提高細胞的致瘤性與轉移能力。他們發(fā)現無轉移特性的中國倉鼠卵巢細胞(Chinesehamsteroverycell，CHO)在過表達PRL-3以后，在體外表現出增強的遷移和侵襲能力，而且經裸鼠尾靜脈注射這種細胞能促進廣泛的肺和肝轉移瘤的形成。Wu等發(fā)現PRL-3在高轉移性的黑色素瘤細胞B16-BL6中高表達，而在低轉移性的黑色素瘤細胞B16中低表達。將PRL-3cDNA轉染到B16細胞，發(fā)現PRL-3過表達B16細胞由上皮樣變?yōu)槔w維樣，表現出體外遷移、侵襲、擴散及增殖能力的增強，并能在裸鼠體內促進黑色素瘤的生長和肝、肺轉移瘤的形成。Qian等[11]用RNA干擾技術下調B16-BL6細胞中PRL-3表達水平后，發(fā)現細胞的體外粘附及遷移能力明顯降低;體內實驗發(fā)現PRL-3表達下調明顯抑制了腫瘤的生長及局部淋巴結侵犯，并延長了荷瘤鼠的生存時間。

RNA干擾技術是近幾年發(fā)現和發(fā)展起來的新興基因阻斷技術，通過內外源性雙鏈RNA觸發(fā)同源性mRNA的降解，從而使該基因表達沉默。基因治療的臨床應用及其效果依賴于載體系統(tǒng)的優(yōu)化及轉染效率的提高。慢病毒載體是一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體，來源于人類免疫缺陷病毒(HIV-1)，具有可感染分裂期與非分裂期細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應等優(yōu)點，因此成為攜帶干擾RNA理想載體[12]。在本研究中，我們用慢病毒介導PRL-3特異性siRNA感染肝癌SMCC7721細胞后，PRL-3在mRNA和蛋白水平的表達均明顯下調。Matrigel的成份類似于體內基底膜，為了評價PRL-3是否和肝癌細胞的侵襲能力有關，我們用Transwell體外侵襲試驗檢測PRL-3表達下降后細胞侵襲行為的改變。結果發(fā)現，與空白對照組及陰性對照組相比，PRL-3特異性siRNA感染組細胞由于PRL-3表達水平下調而導致其體外侵襲能力明顯下降。

本研究的結果初步提示我們PRL-3可能在肝細胞癌的侵襲轉移過程中起重要作用。目前對PRL-3的作用底物及其促進癌細胞侵襲轉移的機制尚未明了，有研究發(fā)現可能與PI3K-Akt，STAT3-Rho，Csk/Src及p53等信號傳導通路有關[13-16]。進一步研究PRL-3在肝癌中的作用及機制，將為其成為肝細胞癌轉移復發(fā)的預測指標和治療中的作用靶點提供理論基礎。

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