.466.297.466.242.73120.114.4圖4-2過Q-Sepharose的SDS圖譜1~7以及9道是經Q-Sepharose洗脫收集的；8、標準蛋白質4.5AK經各步純化后的SDS電泳圖譜如圖5-1為細胞破碎離心得到的上清溶液以及通過各步純化后所得溶液的SDS電泳圖。由該圖可知，我們經過的純化策略達到了比較理想的效果。123456如圖5-1，AK經各步純化后的SDS圖譜1、標準蛋白2、上清3、鹽析4、經過CMC處理的蛋白質5、經過S-100處理的蛋白質6、Q-Sepharose5討論（1）由于精氨酸激酶基因的菌種是保存甘油中，我們在進行接種擴大培養到含卡納霉素的LB培養基錐形瓶中，首先要把原菌液接種到含LB培養基的小試管中進行活化8－12小時。由于不同的菌種的生長情況有差異，在加IPTG值的要求不同。根據參考文獻得出，誘導AK基因表達最適宜的OD600值為0.6～0.8，另外，我們通過實驗得出，IPTG誘導時間為3小時。IPTG終濃度，為0.2（2）由于誘導AK表達的IPTG的濃度較低，小于1mM的情況下，不易產生包涵體，因此，我們在后面的破壁、離心、分別取上清和沉淀，分別用測活和電泳檢測，發現沉淀中幾乎沒有AK。（3）根據參考文獻得出，精氨酸激酶活性可以通過測定在575nm處精氨酸激酶1min內的下降值。所用底物主要包括Arginine，Mg(AC)2。觀察精氨酸激酶的熱力失活曲線知道精氨酸激酶在30℃活性最高，另外pH值的變化對精氨酸激酶的活性影響很大，當pH等于8.2時活性最強。測活時底物的要放在25（4）將粗提的蛋白首先通過CMC陽離子交換層析，將帶正電荷的雜蛋白掛于柱子，精氨酸激酶和其它蛋白洗脫出來，由于CMC陽離子交換層析有稀釋作用，以及分子篩對上樣體積的要求（柱床體積的5％－15%），所以需要濃縮洗脫液，然后通過S-100凝膠過濾層析，再經過Q-Sepharose陰離子交換層析進行進一步純化，精氨酸激酶能結合于柱子，但是卻能掛上大量的雜蛋白，然后用1mol/L的NaCl進行梯度洗脫分部收集得到較純的精氨酸激酶，由公式計算得NaCl濃度為0.23M時，AK蛋白開始洗脫下來。在這個過程中都要進行測活以及電泳圖譜來確定精氨酸激酶的活性和純度。（5）由電泳圖譜可看出經過于S-100凝膠過濾層析分離純化的效果不是很明顯，主要原因是精氨酸激酶（40KD）附近有許多雜蛋白的電泳帶，而SephacrylTM—10的分離范圍是103－105。這個范圍較大，難于把雜蛋白分開。（6）要有好的分離效果要注意層析柱的高度和體積；上樣量的大小；洗脫梯度的形狀和洗脫體積；洗脫速度；分級物的收集量。參考文獻：[1]FranceRM,SellersDSandGrossmanSH.Purificationcharacterizationandhydrodynamicpropertiesofargininekinasefromgulfshimp(Penaeusaztecus).ArchBiochemBiophys,1997,345(1):73-78[2]ZhouG,somasundaramT,blancE,etal.Transitionstatestructureofargininekinase:implicationsforcatalysisofbimolecularreaction.ProoNatlAcadsciUSA,1998,95(15):357-359[3]TsouCL.Configurationalflexibilityofenzymeactivesites.Science,1993,262(5132):380-381[4]潘繼承精氨酸激酶的折疊及其部分結構的研究博士學位論文北京：清華大學F2004(4):1-2[5][美]J.薩姆不魯克D.W.拉薩爾分子克隆科學出版社上冊15章（1217－1259）。[6]France,RichardMorris,Ph..DPurificationandphicicalcharacterizationofargininekinasefromPenaeusaztecus:Evidenceforamoltenglobulefoldingintermediate.UnivercityofSouthFlorida,1994(1)[7]YuZ,PanJandZhouH.MAdirectcontinuouspHspectrophotometricassayforargininekinaseactivity.Proteinandpeptideletters,2002.9(6)545-55