植物反應器生產藥用蛋白的研究進展李世成現代基因工程技術最初是建立在結構簡單的微生物，尤其是以大腸桿菌為受體表達外源蛋白，用植物反應器生產藥用蛋白的思路出于偶然。二十世紀八十年代，比利時PGS公司的科學家將一個神經肽（enkephalin，腦啡肽）編碼基因轉入煙草中表達，用意在于讓癮君子們不用抽煙，只需拿煙葉聞一聞或放在口中嚼一嚼即可過煙癮，以此減少尼古丁對人體的危害及減少空氣污染。他們在這個小肽基因兩端設計了兩個蛋白酶的酶切位點，將改造后的基因串聯導入煙草細胞并成功獲得再生植株，結果小肽以多聚體的形式表達存在，用胰蛋白酶和羧肽酶作用后獲得了神經肽，每粒種子在200nmol。雖然，他們的目的最終沒能達到，因為神經肽要經血液運輸而起作用，在口腔及消化道內會被降解掉，但他們卻意外地找到了一條利用轉基因植物生產藥用蛋白的途徑，引起人們對此領域的關注。尤其是轉基因植物生物反應器的研究和開發使植物能以極低的費用大量生產藥用蛋白,具有極大的商業價值。。植物反應器生產藥用蛋白的優點利用植物反應器生產藥用蛋白已成為制藥產業重點開發的熱點領域。通過植物基因工程技術，在轉基因植物中生產藥用蛋白及多肽疫苗，具有微生物或動物反應器不可替代的獨特優點（見表1）。它們不僅可以對真核生物蛋白進行準確的糖基化、酰氨化、磷酸化、亞基的正確裝配等翻譯后加工，使表達產物具有良好的生物活性和較低的免疫原性，而且也不像細菌在發酵過程中那樣由于產生不溶聚合物—包涵體，而需要將它們重新溶解并折疊成天然蛋白質，這一過程所需要的成本很高；不僅如此，植物反應器也不會像動物反應器那樣含有人類的潛在病原或其他污染等潛在的威脅；另外利用植物反應器，來源廣，可進行大量田間栽培；轉化植株系的種子易于儲存，有利于重組蛋白的生產和運輸；投資小，成本低。據推算，利用轉基因植物生產藥用重組蛋白的成本，僅為利用大腸桿菌發酵生產成本的1／10～1／50。表1微生物、動物和植物反應器的比較撇原核殘微生余物反塔應器私植物協反應逗器估動物遙反應棍器歲真核上蛋白陵翻譯飲后加箏工的斥能力沖有限通；杏上游轟生產洗成本轎較低葵；墓細胞鍛培養采需要仙用胎靈牛血貿清作嚼為生味長培柱養基益，以魚及從關培養謙上清負中提柳取，吸成本標昂貴馬；準細菌域發酵雕常形袖成不沿溶聚玻合物餅或回班收率塵低；商基因敏轉化區容易碗、成野功率漏高、由周期屑短、挎表達藥量高拼、提止純容話易、逝收效都快（當少于客兩年隨）；桂轉基袋因動棒物生忽長繁庸殖、搖飼養趁條件暮及營側養要綢求高焦；愁宿主俊菌的粥表達降藥物進種類秒及表雖達量咱有限乏；裕轉基你因植遭物自件交后貌得到蘿的同沿質后益代的幕遺傳觀性狀聯穩定帳；進嫩而在衰植物攝體內蟻積累恥多基落因；判基因連轉化蹤難度湖大、姜轉化井成功應率低館、生辱產藥農物等蝶待周油期長榆（牛責需要脊7年羊，羊愉需要溝3年散）；嗽噬菌守體等墨污染恩造成魯倒灌應的威帝脅；桐不存趣在噬哲菌體押污染娃造成昌倒灌名的威術脅；伙動物察反應致器的從污染壩問題古；削下游污加工以復雜擦、成芬本高繁；餓發酵需常常薯需龐勤大的鋸設備航投資蓮。移可食蹲藥物罪節省授下游橡加工絕開支粘；檢轉基棕因動弓物易睬產生爐社會烏和倫著理問呆題。植物反應器生產藥用蛋白研究進展近20年來，隨著植物基因工程的迅速發展，在植物抗蟲、抗病毒和品質改良等方面已取得了舉世矚目的成就，同時利用轉基因植物生產藥用蛋白等為攻克醫藥難題也開辟了新的天地。科學家正逐漸把藥物的生產從微生物轉向植物，在這方面許多國家競相研究。據不完全統計，目前已有幾十種藥用蛋白或多肽在植物中成功表達，一些研究機構或公司已開始從這些藥物蛋白的生產中獲得了巨大經濟效益。1、植物抗體自從十幾年前轉基因煙草成功地表達免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因并組裝成功以來,植物已經能夠生產完整的IgG和IgA分子,分泌型IgG和IgA分子,單鏈可變區片段(scFv),Fab片段和重鏈可變區以及雙特異性抗體(通過具柔性的肽鍵接頭連接到一起),膜錨定抗體以及嵌合型的IgG和IgA分子等不同類型抗體。應用植物生產單克隆抗體具有極大的市場潛力,獲得的價格低廉的單克隆抗體在人類及牲畜的疾病治療中將發揮巨大的作用。目前已經成功地獲得具有潛在醫療價值的植物抗體。主要有轉基因煙草生產針對腐蝕牙齒的致病原Sreptpcpccusmutans抗體IgG-IgA、人抗皰疹病毒(antiherpessimplexvirus)的抗體、針對癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)的抗體、利用植物病毒載體侵染煙草瞬時表達淋巴瘤特異的疫苗等植物抗體全面用于診斷和治療需要解決的主要問題包括產品的數量和質量、下游純化工藝、糖基化等。通過調節表達元件、優化密碼子以及提高抗體的穩定性可提高表達系統中重組抗體的積累水平。重組蛋白在植物體內的糖基化(glycosylation)方式與在人體內不同，這一問題近年來引起人們的關注，因為不同模式的糖基化會對人體形成免疫原性。一些專門的研究工作就是針對如何消除這種免疫原性的，如在不需要糖基化仍具有抗體活性的情況下，將抗體中有關植物N-糖基化的識別序列去除。對于高爾基體介導的糖基化，只要在抗體的C末端附加內質網滯留信號肽KDEL，就可避免糖基化。另一種非常理想的方法是將植物糖基化方式轉變為適合人體的糖基化，如將人的β-1,4-乳糖基轉移酶（galactosyltransferase）轉化煙草，然后再與表達鼠抗體的煙草雜交，其后代產生的抗體就完全適合于人體了。這有助于消除對植物抗體作為人類藥物可能存在免疫原性和致敏性等問題的憂慮。而且人類食物中普遍存在植物糖蛋白,因此對多數人而言,植物抗體的應用不會存在危險。2、口服疫苗轉基因植物生產口服疫苗的前景非常誘人。在植物組織內合成某種致病原的關鍵免疫原性蛋白,然后作為可口服的亞單位疫苗給人和牲畜服用,人或動物的體內就會產生相應的抗體,具有抵抗該致病原的能力。迄今為止,在植物中表達用于疫苗研究的病原基因主要有乙肝疫苗、大腸桿菌熱敏腸毒素B亞單位(LT—B)基因、霍亂弧菌毒素B亞單位(CT—B)基因、Norwalk病毒衣殼蛋白疫苗、豬傳染性胃腸炎病毒S糖蛋白(TGEV—S)基因、口蹄疫病毒VP1蛋白(MDV—VP1)基因、狂犬病病毒G蛋白基因、兔出血病病毒(RHDV)VP60蛋白基因等。另外結核桿菌分泌蛋白MPT64基因在胡蘿卜中獲得了表達,輪狀病毒結構蛋白vp4、vp7基因分別在馬鈴薯中獲得了表達。與注射疫苗相比,口服疫苗成本低、便于管理,是一種很有市場前景的大眾免疫防護方式。口服疫苗還能夠提高黏膜免疫力,提高對通過黏膜表皮進入人體的傳染性因子的抵抗能力。目前對于口服疫苗的主要憂慮在于:蛋白質成分在胃腸中的降解是否在引發免疫反應之前。為了防止降解,人們利用重組微生物,脂質體以及轉基因植物組織運送這些蛋白質,使這些蛋白質能夠完整地到達腸部,引發免疫反應。目前已開發了幾種有效的制劑，如生物膠丸。庫另外房，銜表達透水平浸一直蠟是關腎注的良焦點駱。炸在現肝有的孩研究婦中稈,隊外源完基因彩所表爆達的住重組艇蛋白榴大約嶄只占濾植物吊中可法溶性爹蛋白難的皆0址.搶01當%葬～栗0赤.必37折%托,戴即使介以高杏表達推量者除為標莫準源,液此表堵達量牧作為扔疫苗訊仍然可很低約。那恭么如紫何提沉高轉果基因脹植物槳的抗屬原蛋眠白產輛量喬?水針對粥這一塵問題姓,已解決材方法匪是型通過合對目巖的基疑因的逝修飾斗，如尼附加免先導外序列活和蹦po與ly擇（港A律）信以號、詠優化捉密碼掌子以循適應棉植物祖系統肺或通炭過轉暮基因倡植物溝與各暑種遺腔傳背驗景雜駝交，望都可掏提高梳表達滔水平秩。慌表達幼產物蘇在細惜胞中蛙的定秀位也亡很重倆要，賞關系基到轉或譯后觸加工貸及產注品的粘穩定斷性。相對于浸亞單騰位疫塊苗而洞言駝,幟適宜蜓表達艦部位位是細篇胞表叼面、溉內質婚網以勇及高績爾基蓋體。郊人們庭還將卸疫苗得基因斷與植蒜物病玻毒表哀面蛋名白基哪因融喜合構病成瞬送時表歉達系苦統懲,食也得請到了考較高覺的表何達水腹平。昌還有錢一個醋相關矩的策涌略是菠用來炮抵抗懇自身狀免疫柿疾病膨:衫利用駝轉基蓋因植驕物表困達自吉身抗董原作駛為口哈服疫弦苗暫,劈服用宿較大孕劑量需的自浪身免透疫原膽產生見免疫子耐受望,休進而曾達到體抑制勿自身慰免疫禁疾病席的發零生。霸這一黨策略島已經粒在治忽療糖資尿病攤的小霞鼠模奏型中之獲得盛了成夾功。耗3、朝其他瘡蛋白秋質淹生產璃具有餡藥學議活性駝的植哥物蛋蚊白和故多肽傷是近坐年來木轉基扶因植宵物應宰用的苦另一漫迅速梳發展咐的領展域。烈大量夠研究刮表明員，人耍體內黨含量嶄甚微售但具攜有重添要臨冶床價鬼值的翼蛋白脾或多幣肽也與可在術植物險系統他中表出達。瞇如升人生斃長激圍素、載人血照清白厚蛋白啦、人左干擾或素熟β碌、人該蛋白隙C濫、訊人表情皮生糕長因悶子、媽紅細扁胞生究長素涼、脂風肪酶河、乳慌鐵蛋溪白、陶水蛭知素、庸膠原誼蛋白塞等。塑目前閘生產叔實踐塊中面呈臨的雷主要拍問題幅仍是者表達波水平詞過低提。熄編碼忘人源幼蛋白離質的娃基因窮在植盟物中蘆的表犬達量程很低丑:監人血老清白效蛋白匠(h材um翁an底s恨er那um懂a供lb刪um折in限)侍占植板物蒼TS舍P少的膛0.演0劈20撞%瓜；秧人蛋葵白瓶C(屠hu鍛ma斗n鏡pr志ot爺ei倚n惹C)頓占恥0.句00虛1%滋；泛紅細叔胞生谷成素笛(e車ry糧th源ro汪po縱ie抓ti貌n馳,E嗚PO燃)能占憑0.做00搶3杜%辣；面人干授擾素腰β磚(h掏um卷an企i臺nt銅er捷fe姨ro傳n-根β燦)撐不到筆0.態00扇1紋%(屢鮮重笨)司。人撓工合筋成的亭人表賓皮生艙長因枕子痕(h拜um狀an有e帳pi沈de扣rm楊al膛g秩ro金wt棗h粒fa秘ct府or慣)瓦基因墊在轉碰基因跳煙草拖中表泳達量概僅達瓣到齒TS峽P殼的校0.酷0搞01卡%撲。蔽一般悟來說郵，在煌臨床廢應用余中需嘉要純然化的軋重組朽蛋白塑表達她量應貫占轉臂化細冬胞惑TS集P爪的旺1%則以上上時才丟具有錯商業例價值猴。因蕩此虹,墾真正也用于咐生產膚還需蓬做大巾量工魂作。所為了竄進一塞步提柿高人掠源蛋碧白在愉植物防細胞娛內的虧表達盛水平薪,補人們浩采用喜的策唱略勸:刃(1杏)夫希望印在葉呆綠體蔑內合昂成復竿雜的賠需要瀉翻譯謊后修缸飾的瓦或亞著基裝仇配的洪真核授蛋白倘質鋪,代如麥sI蠅gA評分；跟在高避等植號物葉隸綠體葵中表碎達外語源基叼因是嗎一種安可供健選擇旗的轉加基因差體系露。整拳合到攀煙草袍葉綠缺體基級因組簡中的北外源悄基因只拷貝執數能寄夠達華到每收個細攜胞藍10別00離0合個拷匠貝俱,里相應絡的重虎組蛋華白占怖全部秘可溶資性蛋班白的菌比例摟也提血高到悶47疏%牌；家(2增)欄蛋白統質靶厚向定閉位貸:芬重組畜抗體揉不在熊細胞冷質中優而是彩靶向移定位鑼在離店質體包(a劑po委pl傅as努t)嫩耳的表危達策誰略明去顯提捐高了簡重組脫抗體慈的產檢量趙；暢靶向晉定位損在內存質網岡的重含組蛋澆白的糠表達允水平碌提高評了沒10校～閑10累0劃倍壺；皇(書3)辨沉植物負中遺盯傳密聞碼子烈的使黨用頻減率與犁動物鈔不同沈,貿對外古源基杜因的感一些趙密碼貫子進擺行替柿換能數夠顯華著提的高該害基因燥在植誦物體耐內的偷表達搜水平閘；森(4允)多使用步組織顏特異僚啟動驅子和跑病毒已序列姓能夠逐提高裹基因組轉錄靜和翻煙譯的烏水平宜；頸(5乞)暢在擬堆南芥選中生好產豆寇類剪ar尤ce嫁li慮n顛,兵同時槽表達污種子爛儲存伙蛋白息清蛋列白或(a膜lb羨um連in護)揚2S管憶的反技義基癥因許,灶結果每使得篇ar銷ce定li辟n局的表耕達量河達到收種子餃總蛋眾白的喇24會%,潔利用鍬相似熊的策咳略有黑助于捕顯著躬提高尋目標嫌蛋白義的表護達水沖平。害藥乓用豪蛋白醬的表惡達策慨略銳在植烤物中跳生產鉆藥物擇蛋白站主要遵通過細兩個旦途徑趣：第僑一條墓途徑柜是利腦用土出壤桿宇菌或膏農桿軌菌屬競（A屢gr幣ob瓦ac瘦te牲ri淹um走）介株導轉掌化法萍、粒果子轟貢擊法板或其圣他標碰準轉轉化技宿術，優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