高效液相色譜技術在食品營養(yǎng)中的應用第一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜技術是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

高效液相色譜法定義：第二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二溶于流動相(mobilephase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法

高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。原理及應用領域：第三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。②高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。③高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng,進樣量在μL數(shù)量級。④應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。

高效液相色譜法特點————“三高一廣一快”⑤分析速度快、載液流速快：較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內即可完成，一般小于1小時。第四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二●高效液相色譜法主要類型：

液固吸附色譜1液液分配色譜2凝膠色譜4鍵合相色譜3第五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二一.液固吸附色譜

1.1分離原理液固色譜是基于各組分吸附能力的差異進行混合物分離的，其固定相是固體吸附劑。

1.2固定相吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。1.3流動相流動相要求：

①選用的溶劑應當與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性

②選用的溶劑應有高純度，以防所含微量雜質在柱中積累，引起柱性能的改變。

③選用的溶劑性能應與所使用的檢測器相匹配，如果使用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測器，就不能用梯度洗脫。目錄第六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二市場價格：11000RMB/噸純度99%以上，含氮量高達66%純牛奶的蛋白質含量約為2.9%左右，而一般蛋白質含氮量16%。在檢出三聚氰胺的產品中，石家莊三鹿牌嬰幼兒配方奶粉三聚氰胺含量很高，其中最高的達2563mg/kg，其他在0.09-619mg/kg之間。第七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二第八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二二、保健食品中主要功效成分的檢測方法及原理第九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二第十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二傳統(tǒng)測蛋白質的方法—凱氏定氮法是根據(jù)測定樣品中的含氮量來計算其中的蛋白質的含量：含氮量×6.256.25為蛋白質的含氮系數(shù)三聚氰胺事件發(fā)生的原因：(1)檢測方法的局限性！(2)利益的趨勢！(3)科學普及的不足性！第十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二HPLC法檢測功效成分的原理和方法第十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二●高效液相色譜法的特點:熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。高壓高效高速高沸點第十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二流程及主要部件1.流程第十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二2.主要部件

主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕等特性(1)高壓輸液泵第十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二(2)梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內梯度:一臺高壓泵,通過比例調節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二(3)進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結構如圖所示：第十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二(4)液相色譜檢測器

a.紫外檢測器應用最廣，對大部分有機化合物有響應。

特點：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。第十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二b.光電二極管陣列檢測器

紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二光電二極管陣列檢測器第二十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二c.示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比

通用型檢測器（每種物質具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉式、反射式和干涉型三種；第二十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二d.熒光檢測器對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應；

高靈敏度！高選擇性！第二十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二Ⅱ高效液相色譜法(HPLC)檢測青蒿素含量一．實驗原理

HPLC原理：利用樣品分子在固定相（填料柱）和流動相之間相互作用力大小不同而實現(xiàn)分離。高壓可提高溶質組分移動速度。按溶質組分與固定相之間的作用機理分類：①吸附分配作用：反相、正相和疏水性色譜；②電荷作用：不同類型的離子交換色譜；③空間排阻作用：凝膠過濾和凝膠滲透色譜；④生物特異性作用：親和色譜。第二十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二流動相——極性溶劑酸性、低離子強度水溶液，加入一定比例的能與水互溶的有機改性劑，如乙腈、甲醇、異丙醇等有機溶劑

；

固定相——非極性填料孔徑30納米以上的烷基鍵合硅膠填料：短鏈烷基（如C4、C8和苯基）；長鏈烷基（如C18、C22）烷基的鏈越長，固定相的疏水性越強，流動相中加入與水互溶的有機溶劑，以提高洗脫速度。反相高效液相色譜（RP-HPLC）機理：利用溶質組分與固定相間疏水作用力不同而分離。第二十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二流動相——極性溶劑；固定相——非極性填料組分性質作用力固定相流動相移動速度保留時間A組分B組分非極性強非極性弱大小小大

慢長

快短青蒿素堿性溶液定量生成α?β—不飽和酮酸鹽

酸化穩(wěn)定的化合物，在260nm處有吸收峰，可用高效液相色譜紫外法檢測。第二十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二二.操作方法溶液配制：1．0.2%NaOH溶液500ml：稱取1.00gNaOH去離子水溶解

500ml；2．0.08mol/L醋酸溶液：

吸取冰醋酸2.30ml去離子水500ml

3．0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4pH7.0緩沖液（流動相）：稱取Na2HPO4·12H2O固體1.79g蒸餾水500ml稱取NaH2PO4·12H2O固體0.68g蒸餾水500ml混合，調pH7.04.

1.00mg/ml青蒿素標準液：精確稱取50.0mg青蒿素標準品無水乙醇

50ml（容量瓶）5.樣品液：分別精確稱取青蒿素粗品50、100、150mg于10ml具塞試管中無水乙醇5ml超聲波振蕩促溶→轉移至10ml容量瓶中

無水乙醇10ml第二十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二流動相處理:微濾器（膜孔0.22μm）

pH7.0磷酸緩沖液

超聲波振蕩器脫氣15min

HPLC進樣器第二十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二10ml具塞試管進樣液制備：樣品液(標準液)1.00ml

0.2%NaOH溶液4.00ml

45℃水浴反應30min

冷水浴冷卻至室溫

0.08mol/L醋酸5.00ml

針頭微濾器(0.2μm)注射器吸進樣液1ml第二十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二恒流泵A恒流泵B紫外檢測儀A液水相B液有機相LC-100液相色譜儀

進樣器色譜柱第二十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二液相色譜儀的啟動順序：打開排空閥，抽出流動相，排除空氣打開高壓泵和檢測器的電源開關，檢測器自動開始自檢啟動電腦；插入U盤，軟件自動初始化；設置波長。

設置總流量、A和B兩液的比例、泵壓、啟動泵。設置自動停止時間、各項屏顯參數(shù)、文件名及保存路徑。

先通入流動相沖洗管路系統(tǒng)，基線走直后，進樣20μl

第三十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二HPLC的圖形結果色譜圖(Chromatogram):色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖,其縱坐標為信號強度,橫坐標為時間←色譜峰時間(分)基線↓峰高峰寬響應值第三十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期二液相色譜圖名詞術語(1)色譜圖名詞術語:色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過檢測器時產生的響應信號峰底(Pea