目ChIPChIP DNA全全3455811 Prader-WilliRett ICF病Beckwith-WiedmannAngelman癌復合物，每個核小體由大約147bpDNA盤繞結構以及DNA包裝對表達的控制受到表觀遺傳機制的影響，這涉及到許多酶的活癌組蛋白修飾、染色質重塑以及經由非編碼RNA的信號通路。盡管組保持相對靜止，但互補的表觀組適應，并觀組也許反映了復雜疾病如何形成、發展，并從父母向轉移。因此，必須

?????全蛋白A,G和A/G ?轉錄因子）在整個組上的結合位點CHIP異的蛋白質-DNA以及蛋白質之間的相互作或定量聚合酶鏈式反應（qPCR）、（ChIP-chip）或新一代（ChIP-seq）對頗具性。這是一個多步驟的技術，需要劑和好的操作方案能以產生重復可靠的結果。這些可利用商業化的產品和方案來實遍遇到的一些問題，從樣品到DNA分 1 FoldFoldFold E2F3LSFE2F3LSF(MouseH3K9AcJMJD1C panel和MagnaChIP?HT96Kit（貨號17-10077）22ChIP需要表位高度特異的抗體，它們識別天然染色質狀態或可能的交聯構象下的蛋白質或感的修飾殘基。因此，有些蛋白質靶點或表位可能更難開展ChIP，因為與其他蛋白質關聯，或表位通過其他方式遮蔽。然而，考慮到各種抗體候選，許多白也是可ChIP的。目前有越來越多的商業抗體，能檢測許多關鍵的ChIP靶點，如組蛋白和組蛋白修飾、轉錄因子、輔助因子、核酶，以及維持和修復DA的蛋白質。關于信息，請

功能相關聯的翻譯后修飾。組蛋白包括五種H2、3和4形成核小體的結構，而H1是連接組蛋白經歷了多種翻譯后修飾（PTM）：甲基這些翻譯后修飾（PTM）可能改變染色質的結致激活。相反，組蛋白脫乙酰酶（HDAC）最多三個甲團也可通過甲基轉移酶添加到

Acid(E)Acid(E)

cis-trans

Lathametal(2007)。詳見N—SGRGKQGCKARAK…H2A…KTESHHKAKGK…—acphacphN—PEPAKS…KGSKK…KA…H2B…KAVTKYTSSK…— 14 acac N—ARTK…RKST…K…RK…K…RKS…K… 23 89101114171823262728KN—SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV…H4…— 圖像改編自Lathametal.,2007。詳見htt

組蛋白的甲基化可以導致表達或抑制，這取 1所有組蛋白的多個絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基都經歷了磷酸化，這對于轉錄、染色質結構、損傷通路和凋亡都有著不同的影響。在有絲過程中，組蛋白H1和H4（第1位絲氨酸）點特異的磷酸化，而組蛋白H3（第0和28位絲氨酸）的程度更高，這或促進染色質的凝聚和分離，或促進染色質的解聚。特別是，磷酸化組蛋白H3的第0位絲氨酸已經過充分鑒定：它可在G2期到中期檢測到，通常作為有絲細胞的標志。此外，組蛋白磷酸化可能在DNA和凋亡中發揮作用。組蛋白變體H2A.X是第139位的絲氨酸被TM/TK激酶磷酸化，以響應雙鏈DNA的斷裂，可能引起DNA白修飾也可能組蛋白亞基替換，這涉及到一系列酶和伴侶蛋白。1總的來說，不同的組蛋白修飾模式，所修飾的組蛋白殘基的數量，以及這些修飾的時空關系–些通常被稱為“組蛋白（toneoe）”–最終決定了對染色質和DA的影響。0 (MagnaChIP?A/GKit（17-10085）獲得的。Catalogue17-17-17-ChIPAb+?AcetylHistone17-17-ChIPAb+?MonomethylHistoneH3ChIPAb+?Trimethyl-HistoneH3ChIPAb+?Trimethyl-HistoneH3ChIPAb+?Trimethyl-HistoneH3ChIPAb+?Trimethyl-HistoneH3ChIPAb+?Trimethyl-HistoneH317-ChIPAb+?Trimethyl-HistoneH317-ChIPAb+?Phospho-HistoneH3ChIPAb+?AcetylHistone17-關于信息，請 CatalogueChIPAb+?Acetyl-HistoneH417-ChIPAb+?Acetyl-HistoneH317-ChIPAb+?Acetyl-HistoneH417-ChIPAb+?Acetyl-HistoneH417-ChIPAb+?Dimethyl-HistoneH317-ChIPAb+?ChIPAb+?ChIPAb+?ChIPAb+?Trimethyl-HistoneH3ChIPAb+?AcetylHistoneChIPAb+?RNAPolymeraseChIPAb+?Trimethyl-HistoneH3ChIPAb+?Trimethyl-HistoneH3ChIPAb+?AcetylHistoneChIPAb+?Dimethyl-HistoneH3ChIPAb+?Acetyl-HistoneH3(Lys9)PuriChIPAb+?EZH2,cloneChIPAb+?Dimethyl-HistoneH3ChIPAb+?Acetyl-HistoneH33ChIP3??????????與ProteinA和/或ProteinG????蛋白酶驗，我們建議使用MagnaChIP?proteinA/Gkit（貨號17-10086）等試劑盒。快速方案試劑盒提供了一整套經過優化的試劑，在某些情況案的最大區別在于免疫沉淀所需的時間不同。在針對高豐度靶蛋白使用經過ChIP驗證的抗-體時，建議使用快速方案。而在使用驗證的抗體或研究低豐度靶蛋白時，使用標準方案。關于詳細的操作方案，請MagnaChIP?用戶手冊（貨號17-10086）。關于試劑盒、抗體和染色質免疫沉淀所用磁珠的選擇，您也可 6CatalogueMagnaChIP?AMagnaCatalogueMagnaChIP?AMagnaChIP?GEZ-MagnaChIP?AEZ-MagnaChIP?GMagnaChIP?A/G17-EZ-MagnaChIP?A/G17-MagnaChIP?HT9617-EZ-MagnaChIP?HT9617-MagnaChIP-Seq?ChromatinImmunoprecipitationandNextGenerationSequencingLibraryPreparationMagnaChIP2?UniversalChromatinImmunoprecipitationDNAMicroarrayMagnaChIP2?UniversalChromatinImmunoprecipitationDNAMicroarrayQuadMagnaChIP?GTissue17-MagnaChIP?ProteinA+GMagneticMagnaChIP?ProteinGMagneticMagnaChIP?ProteinAMagneticChIPAssayKitEZ-ChIP?Kit

一整套經過優化和質量控制的試劑，經證明適用于專業的技術支持和ChIP實驗可在培養的細胞或組織上開展。在任何情況下，都必須考慮您樣品的均質性，因為每個有貢獻的細胞類型可能有著不同的染色質結構。同時還必須確定您將要開展多少個ChIP反應。每個ChIP反應所需的細胞數量將取決于蛋白質靶點的豐度。在決定每個ChIP反應所需的“染色質對應的細胞量”時，需要考慮的因素包括您細胞中的可用表位數量，以及您抗體的質量（親和力和特異性）。如果您使用高質量的抗體來靶定度的表位，如RNA聚合酶II及一些類型的組蛋白修飾，每個ChIP只用1x104個細胞也能實現成集。當抗體并非最佳或每個細胞的表位數很低時，我們建議您增加細胞數量。表1和2為每種類型的蛋白質靶點所需的細胞數量提供了指南。

優化相對于非特異對照（正常IgG或位置對組織樣品包含異質的細胞群體，對ChIP而言更具性。您可以使用冰凍切片或新鮮組織，切成1-3mm3的切片。ChIP所使用的組織量將取決于組織類型，您的蛋白質靶點的相對豐度，以及您的ChIP抗體的可靠性。一般而言，一顆豌豆大小的組織約含07個細胞，足夠作為00個ChIP實驗的樣品。然而，此數值的準確性取決于組織的相對細胞結構和污染的細胞外基質的量。您應當而迅速地處理組織樣品，將樣品置于冰上，以保證樣品的完整性。高高中中105-（TFIID、低低106-低107表2:

0

利用MagnaChIPGTissueKit（17-20000）和Anti-RNAPolymeraseIIcloneCTD4H8（貨號05-623B）進行實驗。我們利用1g抗體來免疫沉淀各種小鼠組ChIP-ChIP-ChIP-ChIP-因上游的引物（UpStr(-)）通過qPCR評估的。能會形成白色沉淀。使用含有此沉淀的能會形成白色沉淀。使用含有此沉淀的長時間交聯可能遮蔽蛋白質靶點的表醛相互作用，潛在消耗分子，并降是可標準的交聯條件是1%在室溫下只使用分子生物學級別的：交聯穩定了您的蛋白質靶點與相互作用的DNA序列的結合。在某些情況下，蛋白質靶點已與DNA緊密結合，則在實驗分析過程中，就不需要其他的化學交聯，來保留蛋白質/DNA復合物。這被稱為iveCP，或N-CIP。N-CIP適用于組蛋白和組蛋白修飾等靶點。然而，值得注意的是，沒有額聯，核小體上的體內修飾在您的分析過程中仍時有發生。在靶定與A結合較弱的蛋白質時，我們強烈）可利用紫外光、或其他的化學交聯劑開展。對于樣品，交常是首選，因為這種修飾是可逆的，能分離并擴增P富集的A此外，的交聯距離只有2（的蛋白質。也將在DNA結合蛋白和與之相間接相互作用的研究。交聯能夠承受后續復合物。不過，有時候會產生非特異的交

裂解是通過在適當濃度的去污劑緩沖液和-您通過機械力來裂解，使用dounce勻漿器、組織的類型。如果細胞裂解對您頗具性，能會有幫助。這將能確定細胞核是否從細長度（200–1000bp）擇的斷裂方法應取決于您是開展N-ChIP還是當用適當的酶（如微球菌核酸酶）將DN段化，因為機械剪切方破壞天然的組蛋白

1泳道）、蛋白酶消化、，已純化的DN段的瓊

1000200重復已的剪切方案而無需優化可能頗具性。當您的儀器不同于那些方案中所使用的優化應當包括功率設置（vs.間隙時間/休息時間）以及獲得長度為2001000bp的DN段所需的剪切循環數。這個大小很重要，因為下游分析通常只檢測大小為100–200bp的擴增子，包含一個感的結合位點。為了成功優化，每個優化實驗只優化一種參數；例始終保持裂解液冰冷，并間斷超聲，而不是連續，因為超聲處理產生熱量，會使染色質變性。在超聲破碎過程中避免氣泡。會導致蛋白質的表面變性，可能使染色質損失在氣泡中。為了避免這種情況，一開始設為較低功率，再逐步提高。在優化條件時，每個超聲破碎循環后通過瓊脂糖凝膠電泳分析DN段的長度。為了獲得最佳的大小，您應當開展額外的純化步驟，以便在電泳前純化DNA。剪切不足所產生的大的不溶蛋白質:DNARNA復合物可能堵塞瓊脂糖凝膠的孔，并延緩電泳過程。通過消化蛋白質、逆轉交聯、酚氯仿提取和沉淀來純化DA。抗體。如果您的抗體過專門的質量控制和蛋白質靶點和與其結合的DNA序列。幸運的

擇單克隆還是多克隆抗體，在選擇ChIP的商業化抗體時，理別多個表位，這就增加了非特異結合的可能可能在免疫過程中隨時間而變化，除非在

PercentPercent

無論您為ChIP實驗選擇單克隆還是多克隆抗體，您都必須根據您的特定分析來優化您抗體的稀釋度。如果使用過量的抗體，您在蛋白質靶點的免疫沉淀中會獲得成功，但你也會觀察到過高的非特異結合或降低的特異信號。相反，如果您使用過少的抗體，您將觀察到靶點的回收率低，如圖所示。為了獲得最佳的結果，無論您為ChIP實驗選擇單克隆還是多克隆抗體，您都必須根據您的特定分析來優化您抗體的稀釋度。如果使用過量的抗體，您在蛋白質靶點的免疫沉淀中會獲得成功，但你也會觀察到過高的非特異結合或降低的特異信號。相反，如果您使用過少的抗體，您將觀察到靶點的回收率低，如圖所示。為了獲得最佳的結果，ChIP抗體應經過充分鑒定，證明它能與蛋白質靶點結合，經過嚴格的特異性檢測，最好經過CP的驗證。僅僅因為抗體在Westernblot中表現不錯，也不一定表明它在染色質免疫沉淀中表現佳。與Westernblot檢測變性的蛋白質不同，ChIP的0.0060.006Enri

圖8HDAC2HDAC2ChIPonCDKN1ApromoterinU2OS包含對照以消除染色質和抗體的非特異性結對照抗體：使用與您的P抗體有著相同物種和形式（如純化的ve，或腹水）的對照。例如，如果您使用正常的純化的小鼠單克隆P抗體，則使用正常的純化小鼠G作為您的對照。如果您使用純化的兔多克隆P抗體，則使用正常的純化的兔作為對照抗體。或者，如果沒有適當的對照G，您可以選擇使用“無抗體”通常是更好的對照，但對照或

關于檢測組蛋白抗體特異性的可靠方法，我們建議使用AbSurance?組蛋白抗體特異性（貨號16-665、16-668和16-667）。這些在PVDF膜的化學發光檢測系統，而不像方法那樣，需要其他的軟件或昂貴的設備進行檢測。關于AbSurance的信息，詳見第30頁。圖9和0顯示了抗組蛋白H3（Lys4）抗體的特異性嚴格檢測的一個例子，包括AbSurance?組蛋白抗體特異性。多肽抑制分析的特異性評估表明與二甲基組蛋白H3（Lys4）之間的交叉反應性弱。組蛋白多肽，這種分析比多肽抑制分析要簡單得多，也表明了與組蛋白H3（Lys4）的二甲基加合物之間交叉反應性的相似模式（詳見圖）。能識別度的蛋白質靶點，如RNA聚合酶II或組蛋白亞基（通常是H3或H4N端）。陽性他影響實驗的因素，并對故障排除很有幫

26016011080605040302015

使用的抗體只檢測包含特定修飾位點的表位。圖10：多肽抑制特異性分析：組蛋白Lys4）（第5泳道）徹底阻斷了此抗體的活性，而二甲基組蛋白H3（Lys4）部分抑制了此抗體，表明與此加合物存在弱的交叉反應性。泳道指定部分抑制了此抗體（第4泳道）。點雜交、多肽或多肽抑制分析。一些實驗

TrimethylHistoneH3 LayoutoftheAbSuranceHistoneH3AntibodySpecicity123456789A100B10C100D10E16-16-16-16-16-16-16-16-16-16-26-26-100F16-16-16-16-16-16-16-16-16-16-26-26-10G26-26-26-26-47-47-71-71-71-71-1001010H26-26-26-26-47-47-71-71-71-71-101010圖10：利用默克密理博的AbSurance?組蛋白H3抗體特異性（貨號16-667）進行此抗體檢測到組蛋白H3（s4）（綠色），同時也確認了之前多肽抑制分析的數據，與二甲基組蛋白H3（Lys4）（紅色）的親和力低，交叉反應性弱。（陽性對照IgG顯示在12H的位置，呈藍色）。表現，但它有助于優先選擇候選抗體，在理想情況下，抗體經過P的驗證。然而，缺乏P數據也不一定表明此抗體不適用于P。在選擇P研究的抗體時，考慮此抗體現有的所有應用數據，因為可應用實驗越多，抗體應用于P的可能性就越大。例如，一個抗體經過免疫沉淀（P）、免疫熒光（F）或免nt驗證的抗體相比，更有可能產生陽性的P結果。然而，這些應用的驗證并不保證抗體在P中的成功，因為成功的P抗體必須識別可接近的表位，而不受P中經常使用的交聯

（ChIPAb+?17-利用默克密理博的AntiJJD6（貨號0912）收集免疫熒光和Westernblot數據。利用ChIPAb+?JMJD6抗體/引物套裝（17-10263）agnaChIP?Ait（貨號17-408）獲取CP數據。

11

Anti-JMJD6讓JMJD6蛋白免疫沉淀。0

BlockingandBlockingandpreclearingnotEasytohandleduringBeadsarevisibleinReproduciblealsoincreasenonspecicbinding(centrifugationorCP抗體可直接與瓊脂糖或磁珠相結合，也可固定在與蛋白A和/或蛋白G結合的磁珠上。最早的ChIP操作使用瓊脂糖珠，但許多ChIP的長期用戶已轉移到磁珠。磁珠能夠從粗制的染色質混合物中快速分離蛋白質/DNA復合物，此過程使用磁性分離裝置，如MagnaGrIP?Rack（400）、PurePoteome?MagneticStnd（貨號LSKMAGS08或LSKMAGS15）MagnaGrIP?HT96ak（170）。

Slightlyhighercostonbeadsurfacearea)

NotvisibleinHighprobabilityofbeadlossduring瓊脂糖珠在許多研究人員的手中表現不錯，是個更便宜、但更耗時的選擇。這些珠子需要離心分離，可能表現出非特異結合，這可能需要封閉和裂解液預澄清。

蛋白A微珠與兔多克隆抗體表現出最高的親和大多數但并非全部種類的小鼠單克隆IgG。蛋白A/G混合物就抗體類型而言提供了最大的靈活體，而不損害pulldown的效率（詳見圖14）。+?ProteinA,Gvs.

ProteinA,Gvs.

SimilarChIPsignal,LowerSimilarChIPsignal,LowerOptimalat20uLblended1111A

A

G

G

FoldFold

A

A

G

G

圖14：單獨使用蛋白A或G與使用A/G混合物的ChP比較。與較低的背景信號一致，與單獨使用蛋白A或G微珠相比，蛋白/G混合物較晚檢測到gG信號（Cq更高）（左圖）。此外，使用蛋白/G混合物與單獨使用蛋白A或G的Cq相似，表明無信號損失。較低的背景和相似的信號回收表明蛋白A/G混合物的富集倍數更高，如右圖所示。的ChIP信號。另法是將抗體與染色質共同 CatalogueMagnaChIP?ProteinA+GMagnetic 663MagnaChIP?ProteinGMagnetic 662MagnaChIP?ProteinAMagnetic 661

在免疫沉淀之后，抗體、磁珠以及蛋白A或G的表面常常結合有生物分子，但與抗原識別不相關。因此，必須用ChIP特異的緩沖液開展一系列洗滌步驟，以便從您的免疫沉淀物中去除非特異性的染色質、蛋白質和核酸，因為這些非特異性的組分可能明顯增加背景信號，產生高的可變性，并導致ChIP分析。在某些情況下，我們可使用多個緩沖液（和嚴格的TE洗滌），或嚴格性漸增的緩沖液，來減少非特異性分子的結合。其他方案則包括較為簡單的緩沖液體系。無論您使用哪種洗滌方法，您應使用一致的洗滌條件：維持一致的緩沖液溫度、洗滌孵育時間，和洗滌時所用設備的旋轉速度。在某些情況下，增加洗滌次數可能會降低背景信號，不過ChIP信號的明顯改善最終是由您CP抗體的質量和CP靶點的性質決定的。

廓，能捕獲高達300L的磁珠握住1.5mL和2.0mL管（貨號20-通用：磁力架也可用于任何15mL或0.5mL管容易操作：符合工程學設計的磁力架有8

質復合物的蛋白質部分分離。如果您使用磁珠，利用磁力架和適當的洗脫緩沖液（如碳酸鈉緩沖液）可輕松完成洗脫。利用多肽競爭分析也質靶點更大，使得抗體復合物中的蛋白質靶點被替換。這種方法能夠顯著降低背景信號，但5-0柱 在用碳酸鈉等試劑洗脫后，并且在qPC析之前，您必須逆轉賴氨酸殘基和A之間的交您需要進一步純化DNA樣品，利用的組DNA。或者，通過硅膠膜（即離心柱）、磁性

???結合，在與雙鏈A結合時熒光顯著增強。因此，當雙鏈A的拷貝數增加時，熒光信號也增加。檢測也可通過Taq?探針來實現。在這種方法中，熒光報告基團和熒光淬滅基團被摻入單個序列特異的探針中，此探針能識別您的PC++不感的核酸分子在您完成ChIP并純化您的DNA樣品之后，您可選擇開展終點或實時定量PCR（qPCR），以定量您樣品中的DNA。在qPCRDNA樣品與引物、聚合酶、寡核苷酸及檢測熒光基團，如aqa?（熒光報告基團:淬滅基團雜合體）特異探針或YB?een嵌入（無需特異探針）共同孵育。DNA樣品通過DNA聚合酶經歷數個擴增循環，其中上個循環的產物成為下個循環的模板，因此在最理想的反應中，擴增的DA個循環中倍增。qPCR分析能夠通過分析與擴增子的量成正比的熒光信號強度，實時定量多個樣品中的起始DNA濃度。為了實現成功的++不感的核酸分子

SYBR? 在您開始qPCR之前，您必須通過蛋白酶在您開始qPCR之前，您必須通過蛋白酶K要開展（苯酚:氯仿）提取來純化

靶點量較低，則實現Ct需要的循環。通過有方案中通過qPCR分析ChIPDNA的典型量，如50LChIP樣品中取2L，以避免向反應中引入

*MIQE（MinimumInformationforPublicationofExperiments）指南建議在報告qPCR數據時，應以“定閾值”（Ct）。關于此的信息，以及適當的運行對照、數據分析標準和錯誤報告的建議，請訪問httphp 反應效率可通過以 來計算工作的。首先，檢測您qPCR反應的效率

對于一個精心優化的反應，效率應介于95-105%。如果您的效率落在此范圍之外，您對于qPCR優化實驗中所用的DNA標準品，您可以使用片段化、已純化的組DNA，或更方便的是，使用分離自染色質、作為起始樣品的DNA。這個起始樣品在您的總染色質樣品中占很小的比例（2-5%）酶K消化，解交聯，并經過純化，以便為分析開發或效率計算提供一個適當的對照材料。在qPCR儀器的軟件中，如果您的樣品類型選為“標準”，效率通常是自動計算并報告的。

使用精心設計的引物–Ct值最好在18-30之引物完整性差（使用新鮮的引物引物濃度太高（改變引物稀釋度以避免二聚體）無模板對照的污染（使用專門的移液器、

將樣品的log值與qPCR分析所獲得的Ct值作

其中這種方法被廣泛用于以起始A來標準化IPA，分析包括陽性和位點的引物，且擴增效率相同。起始A指的是在免疫沉淀之前獲得的染色質樣品。IPA和稀釋的起始A同時分析，以產生各自的Ct值。為了計算IPA相型。在使用起始DNA作為相對標準曲的標準數變化來表示的。待測樣品也可表示為參考的百分比，此已知在實驗條件下維持恒定的白質，或qRT-PCR表達分析中的看家cDNA。已知未被免疫沉淀蛋白質占據的DNA位點（位點）可作為這種方式中的參考，相對于已相對定量采用?Ct或??Ct方法。這些方法假定您的PCR反應的擴增效率是00%（例如，在反應的線性期，擴增子在每個循環倍增，且E=2），至少是，檢測中的所有分析有著相同的效率。

?Ct=CtChIPDNA–(Ctinput-Log2[Inputdilution%Input=2(-?Ct[normalized(??Ct=?Ctpositive–?Ctnegative)FoldenrientKuo,M.H.,etal.Methods1999;3:425-Zhang,L.,etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.2004;322:705–711. ittgen,T.D.,etal.NatProtoc.2008;3(6):1101-Collas,P.MethodsMolBiol.2009;567:1-Turner,F.B.,etal.MethodsMolBiol.2006;325:261-Nègre,N.,etal.MethodsEnzymol.2006;410:316-Sambrook,J.,etal.ColdSpringHarbProtoc;2006;Latham,J.A.,etal.NatStructMolBiol.44問題/提

我們建議您使用2-10gChIP抗體，這取決于您的蛋白質靶點的豐度和抗體與靶點的親和力。抗體不一定選擇一個通過多項特異性/交叉反應性檢測，并在CIPASrace?組蛋白抗體特異性 如果過表達一個融合的蛋白質，我

IgG當染色質破碎所使用的裂解緩沖液包含高濃度的SS（某些情況下是1%）時，需要對染色質進行十倍稀釋。稀釋染色質能確保IP微珠和抗體不會被變性或因去污劑存在而受影響。在我們的CIP提取ChIPDNA？

如果您之前不曾在CI中研究過這個靶點，我們建議您用1%的處理培養的細胞，室溫下0分鐘。如果您未能獲得富集（并預計蛋白質存在于您尋找的位置），將交聯時間延長至15或2分鐘。如果您過度交聯，您一般會以不依賴位置的方式看到相同的信號。不依賴位置意味著您在已知的結合位點vs.已知的位點（如b遠的位點）觀察到相同的信號。淬滅通常是通過添加甘氨酸來完成的。不過，一些方案也表明，（在固定培養細胞時）用PBS滌停止交聯。這將取決于在您固定細胞時，培養基中是否存在。如果蛋白存在于培養基中，甘氨酸淬滅將更重要。逆轉的，將妨礙ChIPDNA的進一步分析。

一般而言，染色質可從新鮮或冷凍的組織，并在含有1%的溶液中固定15分鐘，但如何做到這一點，17-20000），以一種更為輕松的方法來處理您的組織樣品。目前也有許多發布了組織ChIP的操作方 SYBR?Green的非特異

如 的費用。單重實驗很容易設計，而多個樣品可同時運行，利用經濟的DNA結合如SYBR?Green和適當設計555.1.ChIP用的細 5.2.ChIP用的組必要，在含有20mL生長培養基的150mm培養皿向20mL生長培養基中直接加入550L37%的（或1100L18.5%的），進行交聯。輕輕旋轉胞收集在管中加入2ml預冷的1XPBS，并加入10L的。動細胞。如果您使用懸浮細胞，以800xg離心5分

按照需要分離未固定的新鮮組織。片將豌豆大在20mL冰預冷的PBS中重懸組織，加入550L37%的（或1100L18.5%的），進行交聯。輕獨的管中加入2mL冰預冷的1XPBS，并加入10L

在1-2%瓊脂糖凝膠中上樣10L和20L，以及觀察哪種剪切條件能產生范圍在200-1000

DNA如5.1所述細胞裂解液。改變裂解液體范圍從5X106ml至5X107ml.5005005x2.5x5002x1x5005x2.5x確保樣品始終置于冰上。超聲處理產生熱對于每種細胞濃度，以固定的循環數超聲處理，并按照儀器制造商的指南設置循環之間的間隔。例如，使用soix 儀器和號微型探頭，使用6個15秒脈沖，每次脈沖之間間隔50秒，功率設為6。始終保持管冷卻。從每種條件的超聲后染色質中取出相當于1105個細胞（從最稀到最濃的樣品依次為20L、5L、2L），加入新的管中。沖液至終體積為50L。

苯酚:氯仿。如果苯酚未充分平衡至pH在室溫下以管子能承受的最大速度的80%離心1分鐘。如果有機相和水相未很好地分通常，水相在上層。不過，如果鹽（>0.5小（<200L），使用裝有吸頭的自動重復第1-4步，直至有機相和水相的交界面看不到任何蛋白質。66ImmunoprecipitationKitEZ-MagnaChIP?A/GChromatinImmunoprecipitationKit（貨號17-與nativeChIP

各種組織樣品的可靠

?AB的1mm顯微切割打孔器得300m的冠狀小鼠大海馬，(B?ABFoldFold0Ms

B

FoldFold胞、TNFα處理的HEK293細胞（每次IP相當于3x106個細胞）中超聲處理的染色質，利用4g正常小鼠IgG或4gAnti-NFκBp65（RelA）（NF

0

用MagnaChIP?GTissueKit和Anti-RNAPolymeraseII1g抗體來免疫沉淀各種小鼠組織的染色質。之上游的引物（UpStr）通過qPCR評估的。細 組

1FoldFoldControlE2F3pCREBControlE2F3pCREBLSF(MouseH3K9AcFoxA2(MouseH3T11P(TreatedJMJD1C中所示來源的染色質經過ChIPAb特異抗體（x軸）或IgG的免疫沉淀，使用MagnaChIP?00

Ampli

定量MagnaChIP?-SeqChromatinSequencingLibraryPreparationKit

AA利用1ng、10ng或起始染色質樣品構建文庫，并利用IlluminaGenomeyzer。全組ChIP試劑盒–分MagnaChIP2試劑盒是一種將您的ChIP分析擴大到全組的簡單方法。這些試劑盒是第一個也利用MagnaChIP2?試劑盒，在幾乎任何類型的芯試劑和經過驗證的方案，出可立即用于標記MagnaChIP2?HumanandMouse

利用MagnaChIP2?UniversalKit對市售的比 2:28651Agilent06192955770886454901MagnaChIP2?試劑盒能夠在多種類型的上開MagnaChIP2試劑盒對Agilent244Kpromoter（中）和Nimblegen?humanpromoterarray（下）抗體特異性利用篩選默克密理博高度特色且廣泛的組蛋白抗體所用的多肽技術，輕松評估您的

高質量的純化肽段（純度高于

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11MagnaNuclearRIPKit非編碼RNA（lncRNA、enhancerRNA、miRNA等）下游與RT-qPCR及RIP-Seq完整配套試劑和完善的 提高信噪比，降低背景(ProteinA/G,緩沖液體系貨

MagnaNuclearRIP?(Cross-NuclearRNA-BindingProteinImmunoprecipitationEZ-MagnaNuclearRIP?(Cross-NuclearRNA-BindingProteinImmunoprecipitationMagnaNuclearRIP?NuclearRNA-BindingProteinImmunoprecipitationEZ-MagnaNuclearRIP?NuclearRNA-BindingProteinImmunoprecipitation需要信息，請 —(10,000到1,000,000個細胞試劑盒提供兩種形式：帶或不帶對照抗體和驗證的qPCR

MagnaChIPHiSensChromatinIPKitMagnaChIPHiSensChromatIPKitw/controls

10,000個HeLaPhospho-CREB,Cat.No.17-10131)或IgG(normalrabbitIgG,Cat.No.12-

CpGenomeDirectPrepBisulteKit50rxnCpGenomeDirectPrepBisulteKit U:CpGWIZ?UnmethylatedPrimerM:CpGWIZ?MethylatedPrimerW:CpGWIZ?WildTypeAnti-BANF1,Anti-BANF1,cloneWB,Anti-Bmi-1,cloneWB,WB,Anti-Centrin-Hu,Ms,Anti-Centrin-Hu,Ms,Anti-CHD-4,cloneHu,Anti-dimethylG9aAnti-dimethylHistoneH307-369-Anti-FOXO4,cloneWB,Anti-H2A.Z.2.2,clone1H11-Anti-HIRA,cloneWB,Anti-HistoneDeacetylase6,cloneEPR1698(2)WB,Anti-HistoneH1°,cloneHu,Ms,Rt,Bov,Anti-HistoneH3.3,K27MMs,WB,Anti-hMCM2,clone2-Hu,Ms,WB,Hu,Hu,Anti-LSD1,cloneHu,Ms,WB,Anti-Mad1,cloneBB3-WB,Anti-Mad2,cloneAS55-WB,Anti-monoubiquitinH2AHu,Anti-MybBindingProteinWB,cloneEPR2315(2)Hu,Ms,WB,Anti-Sirt1(Sir2),clone3-WB,Anti-Ski,cloneWB,WB,Anti-SUV39H1,cloneAnti-TCF-4,cloneWB,Hu,WB,Hu,Ms,IP,IC,Hu,WB,Anti-TIP60,cloneWB,Anti-UBE2I,cloneHu,Anti-USP9X,cloneHu,Ms,WB,Hu,WB,Hu,Ms,ChIPAb+?AcetylHistoneH317-Milli-Mark?Anti-acetyl-HistoneH4-Species:Hu=Human,Ms=Mouse,Rt=Rat,Bov=Bovine,Mky=Monkey,Can=Canine,Prim=Primate,Por=Porcine,Chimp=Chimpanzee,RheMac=RhesusMacaque,Ham=Hamster,Chk=ChickenApplications:FC=FlowCytometry,IC=Immunocytochemistry,IHC=Immunohistochemistry,IHC(P)=Immunohistochemistry(Parafn),IF=Immunouorescence,IP=Immunoprecipitation,WB=WesternBlotting,ChIP=ChromatinIP,ELISA=EnzymeImmunoassay,DB=DotBlot,PIA=PeptideInhibitionAssay,CS=CellSorting,MeDIP=MethylatedDNAIP,CC=CellCulture,BM=BisulteModicationSpeciesKeyCatalogueAnti-26SproteasomeregulatorysubunitHu,DotBlot,WB,Anti-ArylhydrocarbonWB,Bov,CanWB,WB,WB,WB,Anti-HistoneMs,Anti-hRNF20Hu,Ms,Anti-HuC/HuD,cloneHu,Rt,WB,Anti-Lin28,cloneWB,Anti-MeCP2,IsoformAnti-NF-E2-relatedfactorRheMacWB,Anti-PHDngerproteinHu,WB,Anti-phosphoCbx706-Anti-Puromycin,cloneHu,Anti-Puromycin,cloneHu,Anti-Puromycin,cloneHu,WB,IC,IF,FC,Anti-RBBP4,cloneAnti-RNApolymeraseIIsubunitB1(phosphoCTDSer-2),cloneMs,WB,04-1571-Anti-RNApolymeraseIIsubunitB1(phospho-CTDSer-7),cloneMs,WB,04-1570-WB,Hu,WB,Anti-SIRT4,cloneWB,Anti-Hu,Rt,Anti-WAC,N-Hu,Hu,Ms,WB,Species:Hu=Human,Ms=Mouse,Rt=Rat,Bov=Bovine,Mky=Monkey,Can=Canine,Prim=Primate,Por=Porcine,Chimp=Chimpanzee,RheMac=RhesusMacaque,Ham=Hamster(Parafn),IF=Immunouorescence,IP=Immunoprecipitation,WB=WesternBlotting,ChIP=ChromatinIP,ELISA=EnzymeImmunoassay,DB=DotBlotNewSmallMolecules&ONSMALLMOLECULES:

Cat.Ezh2InhibitorII,(Cat.No.

Acell-permeableribonucleoside ogofcytidinethatisreportedtoreadilyincorporateintoRNAandDNA,andinhibitproteinsynthesis.CausesDNAmethyltransferasesdepletion,DNAhypomethylationandDNAdamage.

anewinhibitorofEzh2/PRC2(Enhancerofzestehomolog complex2)methyltransferaseactivity.Ina2012PNASpapertitled:SelectiveinhibitionofEzh2byasmallmoleculeinhibitorblockstumorcellexhibitedabout142-foldgreaterselectivityoverEzh1and>10,000-foldselectivityoverseveralotherhistonemethyltransferases(G9a,Suv39H2,Set7/9,CARM1,SmyD2,SETD8,NSD3,SETD2,MLL,andDot1L).TheyalsoreportthatthisEzh2inhibitorblockedthegrowthofdiffuselargeBcell

Ezh2InhibitorII,Acell-permeableindolocarboxamideEzh2InhibitorII,Acell-permeableindolocarboxamidecompoundthatactsasapotentandselectiveinhibitoragainstEzh2/PRC2( brepressivecomplex2;Ezh2/SUZ12/EED/AEBP2/RbAP48)HMTaseactivity(IC50/substrate=15nM/H3K27me021-44and13nM/H3K27me221-44,respectively,againsthumanwtorY641FEzh2-containingPRC2;[SAM]=1μM)inacofactor petitivemanner.JQ1Enantiomers

Acell-permeable,irreversible,triazole-containingheterotricyclic1inhibitorthateffectivelyblocks1-mediatednuclearexport(4h1μMinU2OScells)viacovalentinctionwith1NES-(nuclearexportsignal)bindinggroovecysteine(Cys528inhuman).Apyridinyl-pyrimidinylaminopropanoicacidthateffectivelyinhibitsKDM6familyH3K27m3demethylasesJMJD3andUTX(IC50=18and56μM,respectively,byMALDIMassdetection)inanα petitive,peptide mendedforcell-assays(S)-(+),butnot(R)-(-),enantiomerisshowntotargetbothbromo (BD1&BD2)ofBETfamilymembersBRD2,BRD3,BRD4,andBRD6/BRDTinaKac-(-N-acetylatedlysine)competitivemanner.Acell-permeablepyrrolidinyl-piperidinyl-benzamidethateffectivelycompetesagainstH4K20Me2peptideforL3MBTL3bindingbytargetingthersttwoL3MBTL3 s(K=120nMinbindingstudies binant3MBT

lymphomacellscarryingEzh2mutationsanddiminishedH3K27me3andH3K27me2levelswithoutaffectingH3K27me1.*Qi,W.etal.2012.Proc.Natl.Acad.Sci,USA109,

EpigeneticRegulatorsPanel- Apanelcontaining18potentandselectivesmallacetylationprocess.EpigeneticRegulatorsPanel- Apanelcontaining12potentandselectivesmallHaspinKinaseInhibitor,CHR-Acell-permeableindazolylimidazopyridazinaminecompoundthatactsasapotent