綠色熒光蛋白基因在大腸桿菌中的克隆與表達概覽GFPpEGFP-N3和pET-28a實驗內容實驗目的實驗原理實驗過程GFP綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein,簡稱GFP)GFP基因來源于JellyfishAequoreaVictoria，是Shimomura等于1962年發現的蛋白質，由238個氨基酸組成，分子量約為27Kd。GFP在包括熱、極端PH和化學變性劑等苛刻條件下都很穩定在熒光顯微鏡下，用波長約490nm的紫外線激發后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測；無需任何的作用底物或共作用物,檢測的靈敏度不受反應效率的影響，保證了極高的檢出率；蛋白本身性質穩定；可在多種異源生物中表達且無細胞毒性；其基因片段長度較小(約717bp)，易于構建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發活性EGFP是一種優化的突變型GFP，使其產生的熒光較普通GFP強35倍，大大增強了其報告基因的敏感度。EGFP與其他蛋白的融合表達已有很多成功的例子。GFP絲氨酸－酪氨酸－甘氨酸生色基團蛋白質折疊，生色基團得以“親密接觸”,經環化形成咪唑酮,并發生脫水反應。但此時還不能發射熒光,只有當有分子氧存在的條件下,發生氧化脫氫,方能導致綠色熒光蛋白發色團的“成熟”,形成可發射熒光的形式。GFP藍光、綠光與黃光基因克隆變體GFP分子標記藥物篩選融合抗體生物傳感器信號傳導標記！pEGFP-N3真核細胞表達載體，pEGFP-N3載體上攜帶有EGFP蛋白表達基因很強的復制能力高效的功能強大的啟動子SV40和PCMV多克隆位點具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉染了該載體的靶細胞pEGFP-N3pET-28apET系統（pET-28a）原核蛋白表達引用最多的系統在任何E.coli表達系統中，基礎表達水平最低真正的調節表達水平的“變阻器”控制提供各種不同融合標簽和表達系統配置具有可溶性蛋白生產、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌許多載體以LIC載體試劑盒方式提供，用于迅速定向克隆PCR產物許多宿主菌株以感受態細胞形式提供，可立即用于轉化E.ColiBL21（DE3）表達菌株表達載體和宿主菌的選擇E.ColiBL21（DE3）是表達宿主菌實驗內容得到重組質粒pET-28a-GFP轉入表達菌株E.ColiBL21（DE3）經培養后用IPTG進行三個時間梯度的誘導表達GFP，紫外線下觀察實驗目的掌握重組蛋白的基因表達和蛋白檢測設計思想學習分子生物學實驗主要操作技術實驗原理實驗器材與儀器實驗儀器實驗材料實驗試劑實驗思路實驗步驟將pET-28a-GFP重組質粒轉化入表達菌株·制備BL21（DE3）菌株的感受態細胞

10uLBL21（DE3）菌液接入3mLLB液體培養基，搖床培養過夜二次活化：1:50比例接入新的試管搖床培養2h1.5mL冰上10min

4度，4000r/min離心2min收集細胞棄培養液，加入預冷的Cacl2液600uL，輕懸，冰上20min，4度，4000r/min離心2min棄上清液，加入預冷的Cacl2液500uL，輕懸，冰上5min，4度，4000r/min離心2min棄上清液，加入預冷的Cacl2液300uL，輕懸，即可·將pET-28a-GFP重組質粒轉入BL21（DE3）菌中300uL分成3份，2份分別加入重組質粒2uL，輕勻，冰上30min；1份平行操作（對照）42度水浴熱擊90S，迅速冰上冷卻5min兩管中分別加入LB液體培養基100uL，勻，37度振蕩培養30~60min涂平板：a）分別取50、100、150uL加入重組質粒的感受態細胞懸液涂布于含抗生素的平板b）抗生素板+IPTG+100uL重組質粒的感受態細胞懸液c）對照組感受態細胞100uL+抗生素平板d）正面向上放置片刻，后37度倒置培養20hIPTG誘導重組蛋白的表達重組陽性克隆菌接至3mLLB（Kan）液體培養基中，37度培養16h過夜菌1:50比例接種至4支試管中（每支試管含3mLLB(Kan)），擴大培養2h，測量A600值為0.5，停止分別使用IPTG（最后總濃度為1mmol/L）誘導0,2,4h離心并照相Wisha