分子生物學導論分子生物學研究方法1當前第1頁\共有88頁\編于星期五\17點第四節 DNA重組技術一、目的DNA片段的獲得二、載體（質粒、噬菌體、cos質粒、病毒）三、DNA酶切四、DNA的連接和轉化五、重組質粒的篩選和鑒定1.質粒DNA的提取2.質粒DNA的純化3.重組質粒的篩選和鑒定當前第2頁\共有88頁\編于星期五\17點3DNA重組

DNA重組是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程。又稱DNA克隆、分子克隆、基因操作。當前第3頁\共有88頁\編于星期五\17點重組DNA技術史上的主要事件1967年第一次發現DNA連接酶1970年分離了第一種限制性內切核酸酶，發現了反轉錄酶1972年獲得第一個重組DNA分子1973年完成第一例細菌克隆1975-1977年發明了DNA序列測定技術，1977年完成了全長5387bp噬菌體f174基因組測定1978年首次在大腸桿菌中生產由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素1981年獲得轉基因小鼠和轉基因果蠅1983年獲得第一例轉基因植物1986年GMO首次在環境中釋放1994年第一批基因工程西紅柿在美國上市2000年完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定(1.2X108bp)2001年完成第一個人類基因組全序列測定(2.7X109bp)2005年中、美、日科學家聯合完成水稻基因組全序列測定當前第4頁\共有88頁\編于星期五\17點5第一個DNA重組子（PaulBerg,1972）EcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA當前第5頁\共有88頁\編于星期五\17點6DNA重組的一般步驟1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。當前第6頁\共有88頁\編于星期五\17點73.將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。當前第7頁\共有88頁\編于星期五\17點當前第8頁\共有88頁\編于星期五\17點酶

類功

能限制性核酸內切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進行末端標記實驗或用來進行DNA的連接末端轉移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團重組DNA實驗中常見的主要工具酶當前第9頁\共有88頁\編于星期五\17點10

生物基因組DNA

細胞mRNA反轉錄合成的單鏈cDNA

通過機械切割、核酸限制性內切酶消化等處理成適合克隆的DNA小片段通過PCR技術可以獲得目的基因人工化學直接合成一、目的DNA片段的獲得當前第10頁\共有88頁\編于星期五\17點（一）特點

基因工程載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進入適當宿主細胞自主復制的DNA分子。二、載體在宿主細胞中有獨立的復制和表達的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。分子量盡可能小，多拷貝、松馳控制型。能插入較大的外源DNA片段。載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點是位于檢測表型的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利于重組子的篩選。當前第11頁\共有88頁\編于星期五\17點12多克隆位點lacZ’載體名稱載體大小選擇性標記基因多克隆位點(multiplecloningsites，MCS)指多個限制性內切酶的單一切點。由許多限制酶切位點組成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。當前第12頁\共有88頁\編于星期五\17點13（二）類型從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為：

克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。DNA克隆常用的載體有：

質粒載體（plasmid），如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等；噬菌體載體（phage）；柯斯質粒載體（cosmid）；單鏈DNA噬菌體載體（ssDNAphage）；噬粒載體（phagemid）；酵母人工染色體（YAC）；細菌染色體克隆載體（BAC）等。當前第13頁\共有88頁\編于星期五\17點141.質粒載體是一種染色體外的穩定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環的DNA分子，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。作為克隆載體的質粒應具備以下特點:①分子量小，穩定存在，較高拷貝數；②遺傳標志；③內切酶點。當前第14頁\共有88頁\編于星期五\17點15（1）pBR322質粒載體123來源于pSF2124質粒轉座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）來源于pSC101質粒的四環素抗性基因（tertr）來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori）當前第15頁\共有88頁\編于星期五\17點16（2）pUC質粒載體氨芐青霉素抗性基因(ampr)大腸桿菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列位于lacZ基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(MCS)區段，它并不破壞該基因的功能。來自pBR322質粒的復制起點（ori）當前第16頁\共有88頁\編于星期五\17點17（3）pMD19-T質粒當前第17頁\共有88頁\編于星期五\17點182.噬菌體載體

（1）噬菌體的生物學特性

溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細胞后很快環化，然后進行自我復制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。(烈性噬菌體只具有溶菌生長周期)

溶源周期中，注入寄主細胞的噬菌體DNA是整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復制。(溫和噬菌體具有溶源生長周期和溶菌生長周期)當前第18頁\共有88頁\編于星期五\17點19（2）λ噬菌體A.生物學特性

組成：蛋白質外殼和線狀雙鏈DNA分子組成。DNA長度為48502bp，在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當其注入到寄主細胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環形DNA分子。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區被稱為cos位點（cohesiveendsite）。當前第19頁\共有88頁\編于星期五\17點20

溫和噬菌體一般以溶源生長進行增殖，脅迫條件下也會進入溶菌生長周期。

復制溶源周期隨溶源細菌染色體一起復制;

溶菌周期的早期是“θ”復制，晚期進行滾環復制

基因組成DNA至少包括61個基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分約1／3為非必須區段。

當前第20頁\共有88頁\編于星期五\17點21B.類型插入型（Insertionvectors）這種載體僅僅有一個可供外源DNA插入的克隆位點。如：λgt10、λgt11

克隆能力小，不到10kb置換型（Replacementvectors）這種載體具有兩個對應的酶切克隆位點，在兩個位點之間的λDNA區段是λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如：Charon4載體克隆能力大，20～25kb當前第21頁\共有88頁\編于星期五\17點22（3）M13噬茵體單鏈閉合環狀噬菌體只能感染雄性細菌，外形成絲狀，基因組DNA長約6.4kb，可分為10個區和507bp基因間隔區（IS區），該區可以接受外源DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用作單鏈DNA載體的重要前提。當前第22頁\共有88頁\編于星期五\17點23復制與增殖M13(+)鏈DNA進入細胞內部合成出互補的(-)鏈DNA,此雙鏈形式的M13DNA，稱為復制型DNA。按θ形式進行幾輪復制之后，基因Ⅱ的產物便在RFDNA的正鏈特定位點上作切割反應，形成一個缺口。M13基因組利用大腸桿菌的DNA聚合酶I，以環形的MI3(-)DNA為模板合成M13(+)DNA。當DNA復制叉沿著模板DNA分子轉移到復制終點時，在基因Ⅱ編碼產物的作用下，新合成的(+)DNA便會被切除下去，并進一步環化形成單位長度的M13基因組DNA。當前第23頁\共有88頁\編于星期五\17點243、柯斯質粒載體柯斯質粒(cosmid)又稱粘粒，“cosmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點的質粒。所謂柯斯質粒其實是一類由人工構建的含有λDNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體，具有與質粒相同的結構特點，為雙鏈、環狀DNA。當前第24頁\共有88頁\編于星期五\17點25柯斯質粒具有下列特點：①具有質粒載體的特性。②帶有λ噬菌體的粘性末端(cos區)。③一個或多個酶切位點。④具有高容量的克隆能力。⑤非重組體粘性質粒很小，不能在體外包裝，因而有利于重組體的篩選。當前第25頁\共有88頁\編于星期五\17點26類型：（1）重組型病毒載體

（2）無病毒基因的病毒載體——復制缺陷型可復制型復制缺陷型4.病毒載體組成：（1）病毒復制和包裝元件 （2）病毒基因 （3）插入的外源基因或元件 （4）病毒外殼/外膜當前第26頁\共有88頁\編于星期五\17點27優點：（1）利用病毒天然的感染性進入細胞，轉導效率高； （2）復雜的裝配過程由細胞完成； （3）不同的病毒載體具有不同的表達特點。當前第27頁\共有88頁\編于星期五\17點常用的病毒載體的特點：病毒載體生物學特性適用范圍反轉錄病毒載體

單鏈RNA病毒

8~10kb可感染分裂細胞；整合到染色體中；表達時間較長；有致癌的危險；Exvivo基因治療；腫瘤基因治療。腺病毒載體

雙鏈DNA病毒

36kb可感染分裂和非分裂細胞；不整合到染色體中；外源基因表達水平高；表達時間較短；免疫原性強；Invivo基因治療；腫瘤基因治療；疫苗。AAV病毒載體

單鏈DNA病毒

~5kb可感染分裂和非分裂細胞；整合到染色體中；無致病性；免疫原性弱；可長期表達外源基因；在骨骼肌、心肌、肝臟、視網膜等組織中表達較高；Invivo基因治療；Exvivo基因治療；遺傳病基因治療；獲得性慢性疾病的基因治療。HSV病毒載體

雙鏈DNA病毒

152kb具有嗜神經性；可逆軸突傳遞；可潛伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂細胞；神經系統疾病的基因治療；腫瘤的基因治療。當前第28頁\共有88頁\編于星期五\17點29

根據限制酶的識別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。

Ⅰ類和Ⅲ類限制性內切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內切酶活性。

Ⅰ類限制性內切酶結合于特定識別位點，且沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進行隨機切割，很難形成穩定的特異性切割末端。

Ⅲ類限制性內切酶在識別位點上切割，然后從底物上解離下來。故Ⅰ類和Ⅲ類酶在基因工程中基本不用。1.限制酶的類型三、DNA酶切當前第29頁\共有88頁\編于星期五\17點30Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的DNA限制性內切酶.

它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個順序內進行切割，產生特異的DNA片段；

Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應的輔助因子，識別順序一般為４～６個堿基對的反轉重復順序；

Ⅱ型內切酶切割雙鏈DNA產生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性內切酶的發現和應用，才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質DNA進行改造，從而極大地推動了分子生物學的興旺和發展。當前第30頁\共有88頁\編于星期五\17點當前第31頁\共有88頁\編于星期五\17點32同尾酶(Isocaudamer)

能切割產生相同末端的限制性內切酶，一般是指能產生相同粘性末端的限制酶。具有不同識別序列的限制性內切酶,切割DNA分子后產生相同的粘性末端。例如：SalI與XhoI,BamHI與BglⅡ。所有平末端酶產生的末端均是相同的，但一般不把它作為同尾酶來研究。同裂酶(Isoschizomers)

來源于不同物種但能識別相同DNA序列的限制性內切酶，切割位點可以相同也可以不同。比如Sma1和Xma1，它們均識別CCCGGG，但前者切后產生平末端，后者切后產生粘性末端。當前第32頁\共有88頁\編于星期五\17點33（一）DNA的連接

1.DNA連接酶通過合成相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而修復缺口或催化粘合完全分離的兩個DNA片段。eg:T4DNAligaseT4DNA連接酶（需要ATP作為輔助因子）主要用于：（1）連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；（2）雙鏈DNA分子間的平端；（3）在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。四、DNA的連接和轉化當前第33頁\共有88頁\編于星期五\17點342.粘性末端連接連接后可能出現以下問題：（1）載體自身環化，造成假陽性背景克隆，為避免此問題，可在連接前，用堿性磷酸酶將載體DNA5’-端去磷酸化，這樣只有載體和插入片段之間才能發生連接；（2）插入片段可雙向插入；（3）插入片段可多拷貝插入。當前第34頁\共有88頁\編于星期五\17點353.平端連接平端連接的優點是可用T4連接酶連接任何DNA平端，這對不同DNA分子的連接十分有利。平端連接的主要問題是，它的連接效率比粘性末端低，因此需較多的T4DNA連接酶和較高的底物濃度，聚乙二醇（PEG）可促進平端連接反應。4.人工接頭連接5.利用適配子連接當前第35頁\共有88頁\編于星期五\17點36（二）重組DNA的轉化

1.轉化（transformation）指以細菌質粒為載體，將外源基因導入受體細胞的過程。接受轉化DNA的菌株稱為受體菌株。轉化時，細菌必須經過適當的處理（如電擊法，CaCl2，RbCl(KCl)等化學試劑），使之處于感受態

—即容易接受外源DNA的狀態，然后利用短暫熱休克使DNA導入細菌宿主中。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(R-，M-)，它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。當前第36頁\共有88頁\編于星期五\17點37常用的大腸桿菌菌株：

DH5aJM109TOP10常用的農桿菌菌株：

EHA105LAB4404當前第37頁\共有88頁\編于星期五\17點38（1）將快速生長中的大腸桿菌置于經低溫（0℃）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質球）。步驟：（2）與轉化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復合物。（3）立即將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。當前第38頁\共有88頁\編于星期五\17點（5）涂布于選擇性培養基中分離轉化子。（4）在全培養基中生長一段時間使轉化基因實現表達、細胞活性恢復當前第39頁\共有88頁\編于星期五\17點402.轉染和感染感染：在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。轉染：在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環化，再象重組質粒一樣地轉化進受體菌。但習慣上常把以噬菌體DNA為載體構建成的重組子導入細胞的過程統稱為轉染。當前第40頁\共有88頁\編于星期五\17點41五、重組質粒的篩選和鑒定（一）質粒DNA的提取1.細菌的收獲含相應抗生素的液體培養基里培養→移至1.5ml離心管→離心沉淀細胞2.細菌的裂解（1）堿裂解法（2）煮沸法

從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。當前第41頁\共有88頁\編于星期五\17點42

堿裂解法提取質粒DNA

根據Birnboim和Doly（1979）以及Ish-Horowicz和Burke（1981）的方法修訂而成的應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法之一。優點：收獲率高，適于多數的菌株，所得產物經純化后可滿足多數的DNA重組操作。

基本原理：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不復性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質粒DNA。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質變性。當前第42頁\共有88頁\編于星期五\17點43

純化質粒DNA的方法通常是利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。（二）質粒DNA的純化當前第43頁\共有88頁\編于星期五\17點44上清液加入固體CsCl與EtBr溶液室溫下超速離心(45,000rpm）16小時穿孔取出DNA（320nm）異丙醇抽提溴乙錠緩沖液透析除去殘余CsCl兩倍體積冷乙醇沉淀DNA離心、洗滌、干燥氯化銫密度梯度離心法實驗表明，在細胞裂解及DNA分離的過程中，大分子量的細菌染色體DNA容易發生斷裂形成相應的線性片段，而質粒DNA則由于其分子量較小、結構緊密，因此仍能保持完整的狀態。這種差別對質粒DNA的純化是十分有用的。當前第44頁\共有88頁\編于星期五\17點45缺點

通過氯化銫-EtBr密度梯度離心法雖然可以得到高純度、高質量的質粒DNA，但它操作復雜，需要價格昂貴的氯化銫和超速離心機設備，而且溴化乙錠又是一種致癌物質，如果操作不慎，不僅會造成環境污染，還會危及實驗工作人員的身心健康。當前第45頁\共有88頁\編于星期五\17點461.抗藥性標志的篩選2.β－半乳糖苷酶系統篩選–藍白斑篩選（三）重組質粒的篩選和鑒定

現在使用的許多質粒載體(如pUC系列、pBluescript、pGem和它們的衍生載體)都帶有一個大腸桿菌DNA的短片段，其中含有β-半乳糖苷酶前146個氨基酸的編碼信息及調控序列。在各自獨立的情況下，pBS(pUC、pGem等)和DH5a編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5a融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酶陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。當前第46頁\共有88頁\編于星期五\17點Lac+細菌，在生色底物X-gal的存在下被IPTG誘導形成藍色菌落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性，顯白色菌落。當前第47頁\共有88頁\編于星期五\17點483.菌落快速裂解鑒定法菌落裂解后去除蛋白，直接凝膠電泳檢測4.通過聚合酶鏈反應篩選重組子123456空白PDs5′基因特異引物當前第48頁\共有88頁\編于星期五\17點495.內切酶圖譜鑒定6.菌落或噬菌斑原位雜交BamHⅠ/PstI1234

制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。

目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段，或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。當前第49頁\共有88頁\編于星期五\17點50第五節 基因分離技術一、克隆的概念二、克隆基因的分離1.應用核酸探針2.應用mRNA差別顯示3.應用cDNA差示分析4.應用酵母雙雜交體系5.基因的圖位克隆法6.Microarray(教材p.182-187)當前第50頁\共有88頁\編于星期五\17點51一、克隆的概念克隆可以理解為復制、拷貝，就是從原型中產生出同樣的復制品，它的外表及遺傳基因與原型完全相同。當前第51頁\共有88頁\編于星期五\17點分子水平：DNA克隆，也叫分子克隆。含義是將某一特定DNA片斷通過重組DNA技術插入到一個載體(如質粒和病毒等)中，然后在宿主細胞中進行自我復制所得到的大量完全相同的該DNA片斷的“群體”。細胞水平：指由同一個祖細胞（progenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。個體水平：指基因型完全相同的兩個或更多的個體組成的一個群體。如：從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。當前第52頁\共有88頁\編于星期五\17點1.應用核酸探針分離克隆目的基因二、克隆基因的分離

把基因文庫轉移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進行菌落或噬菌班雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆。這個過程叫做克隆基因的分離或篩選。

應用核酸探針分離目的基因的方法叫做核酸雜交篩選法。此法應用廣泛，相當有效，尤其適用于大規模篩選。當前第53頁\共有88頁\編于星期五\17點542.應用mRNA差別顯示技術(DDRT-PCR)分離克隆目的基因

在生物個體發育的不同階段，或是在不同的組織或細胞中發生的不同基因按時間、空間進行有序的表達方式，叫做基因的差別表達（differentialexpression）。當前第54頁\共有88頁\編于星期五\17點當前第55頁\共有88頁\編于星期五\17點563、應用cDNA差示分析法克隆基因

這種方法能夠充分發揮PCR技術以指數形式擴增雙鏈DNA模板的性質，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法特異性擴增目的基因片段。因為試驗對象（tester）和供試探針（driver）在接受差示分析前均經過一個4堿基切割酶的處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息被擴增。每次t減d反應后僅設置72℃復性與延伸，94℃復性這兩個參數共20個PCR循環，PCR產物的特異性和所得探針的純度非常高。當前第56頁\共有88頁\編于星期五\17點57當前第57頁\共有88頁\編于星期五\17點584、應用酵母雙雜交體系克隆基因5、基因的圖位克隆法當前第58頁\共有88頁\編于星期五\17點596、DNA的Microarray當前第59頁\共有88頁\編于星期五\17點60InfectedIBLUninfectedIBL當前第60頁\共有88頁\編于星期五\17點61第六節 分子雜交技術一、Southern印跡雜交(DNA)二、Northern印跡雜交（RNA）三、斑點雜交（dotblotting）四、Western印跡雜交（Protein）五、原位雜交六、基因芯片七、酵母雜交技術當前第61頁\共有88頁\編于星期五\17點62雜交(hybridization)：兩條來源不同的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們有大致相同的互補堿基順序，經退火處理即可復性，形成新的雜種雙螺旋，這一現象稱為核酸的分子雜交。（注意與復性的區別）核酸雜交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA雜交。當前第62頁\共有88頁\編于星期五\17點63

在大多數核酸雜交反應中，經過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細管或電導作用被轉移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。

分子雜交是目前分子生物學最廣泛應用的技術之一。利用此技術，可以求出特定基因的頻率、基因組織的特點、基因結構和定位、基因表達等。電泳凝膠核酸印跡法斑點和狹線印跡法菌落和噬菌斑印跡法當前第63頁\共有88頁\編于星期五\17點64E.M.Southern于1975年首先設計出來的。材料： 尼龍濾膜 硝酸纖維素濾膜 二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）步驟：第一：將分離的核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上－核酸印跡轉移第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標記的DNA探針進行雜交一、Southern印跡雜交(DNA)

當前第64頁\共有88頁\編于星期五\17點SouthernBlotting的過程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動轉移膠中的DNA3.固定膠中的DNA到膜上4.預雜交和雜交（放射性和熒光檢測）5.結果檢測當前第65頁\共有88頁\編于星期五\17點M1210×SSC轉移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜當前第66頁\共有88頁\編于星期五\17點67

將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。二、Northern印跡雜交（RNA）當前第67頁\共有88頁\編于星期五\17點68當前第68頁\共有88頁\編于星期五\17點69三、斑點雜交（dotblotting）當前第69頁\共有88頁\編于星期五\17點70四、Western印跡雜交（Protein）當前第70頁\共有88頁\編于星期五\17點Step2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopmentStep1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigen當前第71頁\共有88頁\編于星期五\17點72當前第72頁\共有88頁\編于星期五\17點73

組織原位雜交簡稱原位雜交（insituhybridization），是在細胞保持基本形態的情況下將探針注入細胞內與RNA或DNA雜交，雜交反應在載物片上的細胞內進行。

基本步驟是通過適當處理使細胞滲透性增加，探針進入細胞內與DNA或RNA雜交、沖洗等。用放射自顯影或免疫酶法或熒光顯示雜交結果。五、原位雜交（教材P175）當前第73頁\共有88頁\編于星期五\17點74LocalizationofDNALocalizationofRNA當前第74頁\共有88頁\編于星期五\17點熒光原位雜交(FlorescenceIn-SituHybridization,FISH)

一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術。FISH技術是將熒光基團標記特異性的DNA探針，再將標記了熒光信號的探針與待測樣本進行原位雜交，最后在熒光顯微鏡下對熒光信號進行辨別和計數。當前第75頁\共有88頁\編