第二講基因組測序與序列組裝當前第1頁\共有39頁\編于星期三\2點主要內容:什么是基因組什么是基因DNA測序的方法DNA序列的組裝人類基因組計劃水稻基因組計劃后基因組學當前第2頁\共有39頁\編于星期三\2點1.什么是基因組

基因組就是一個物種中所有基因的整體組成。基因組有兩層意義：遺傳物質和遺傳信息。要揭開生命的奧秘，就需要從整體水平研究基因的存在、基因的結構與功能、基因之間的相互關系。當前第3頁\共有39頁\編于星期三\2點Zeamays8,000Homosapiens3,000Oryzasativa400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae12E.coli4.6GenomeSize(Mb)當前第4頁\共有39頁\編于星期三\2點什么是C值？通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量.

在真核生物中，C值一般隨著生物的進化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。

C值悖理：生物的復雜性與基因組的大小并不完全成比例增加當前第5頁\共有39頁\編于星期三\2點細菌真菌等動物陰影部分為一個門內C-值的范圍當前第6頁\共有39頁\編于星期三\2點重復順序高度重復順序：長度：幾個——幾千個bp拷貝數：幾百個——上百萬個首尾相連，串聯排列集中分布于染色體的特定區段（如端粒，著絲粒等）也稱衛星DNA中度重復順序：一般分散于整個基因組中；長度和拷貝數差別很大單一順序：基因主要位于單一順序動物中單一順序約占50％植物中單一順序約占20％當前第7頁\共有39頁\編于星期三\2點是遺傳信息的物理和功能單位，包含產生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。

基因分類：編碼RNA的基因，如rRNA基因，snRNA基因等；編碼蛋白質的基因2.什么是基因？當前第8頁\共有39頁\編于星期三\2點基因的不連續性Intron和Exon:大多數真核生物蛋白質基因的編碼順序(Exon)都被或長或短的非編碼順序(Intron)隔開當前第9頁\共有39頁\編于星期三\2點基因家族一群具有一致的或相似順序的基因,有的還擔負類似的生物學功能,可以相互補償,比如:E2ftranscriptionfactorMousesymbolHumanOrthologE2f1E2F1E2f2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6當前第10頁\共有39頁\編于星期三\2點假基因(Pseudogene)來源于功能基因但已失去活性的DNA序列產生假基因的原因有:由重復產生的假基因;加工的假基因,由RNA反轉錄為cDNA后再整合到基因組中;殘缺的基因(Truncatedgene)當前第11頁\共有39頁\編于星期三\2點重疊基因:同一段DNA能攜帶兩種不同蛋白的信息.

重迭基因有以下幾種情況：*一個基因完全在另一個基因內部*部分重疊*兩個基因共用少數堿基對當前第12頁\共有39頁\編于星期三\2點*一個基因完全在另一個基因內部如：B和A，E和D其讀碼結構互不相同---ATG-----//------AATGCC----//---ATAACG---//--TAA----A*BATGCCN----NNATAA當前第13頁\共有39頁\編于星期三\2點*部分重疊如：K和C*兩個基因共用少數堿基對如：D和J-------TAATG-------D終止密碼子J起始密碼子當前第14頁\共有39頁\編于星期三\2點3.DNA測序的方法鏈終止法測序化學降解法測序自動化測序非常規DNA測序當前第15頁\共有39頁\編于星期三\2點3.1鏈終止法測序(thechainterminationmethod)

基本原理:

通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應，產生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。當前第16頁\共有39頁\編于星期三\2點技術路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸

↓將4種反應產物分別在4條泳道電泳↓根據4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

A克隆于質粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬粒克隆DNADPCR產生單鏈DNAA高酶活性B無5’→3′外切酶活性C無3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基當前第17頁\共有39頁\編于星期三\2點當前第18頁\共有39頁\編于星期三\2點當前第19頁\共有39頁\編于星期三\2點3.2化學降解法測序基本原理:

在選定的核苷酸堿基中引入化學基團，再用化合物處理，使DNA分子在被修飾的位置降解。當前第20頁\共有39頁\編于星期三\2點技術路線

將雙鏈DNA樣品變為單鏈↓每個單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標記，以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理，獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體↓電泳，讀取DNA的核苷酸順序當前第21頁\共有39頁\編于星期三\2點Maxam-Gilbert法所用的化學技術

堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對N7進行甲基化,使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環的N原子化,從而導致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環,后者重新環化成五元環后易除去C1.5mol/LNaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶當前第22頁\共有39頁\編于星期三\2點化學法測序實例哌啶當前第23頁\共有39頁\編于星期三\2點3.3自動化測序基本原理與鏈終止法測序原理相同,只是用不同的熒光色彩標記ddNTP,如ddATP標記紅色熒光,ddCTP標記藍色熒光,ddGTP標記黃色熒光,ddTTP標記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.當前第24頁\共有39頁\編于星期三\2點當前第25頁\共有39頁\編于星期三\2點3.4非常規測序毛細管電泳

用毛細管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳，節省時間，加快測序進程，其他程序同鏈終止法或化學測序法。

當前第26頁\共有39頁\編于星期三\2點DNA芯片測序基本原理將各種排列順序的寡核苷酸點播在芯片上,每個點播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.待檢測的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會在確定位置發出信號,然后根據獲取的信息將寡核苷酸的順序進行對比組裝,拼接成完全的DNA順序.當前第27頁\共有39頁\編于星期三\2點利用基因芯片進行雜交測序的原理當前第28頁\共有39頁\編于星期三\2點4序列的組裝4.1隨機測序與序列組裝

隨機測序也稱”鳥槍法”。序列組裝原理：直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆，然后依次向兩側鄰接的序列延伸。優點:不需預先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測序計算機拼裝當前第29頁\共有39頁\編于星期三\2點ABC小片段測序計算機拼裝鳥槍法(Shotgun)測序的問題CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP錯裝當前第30頁\共有39頁\編于星期三\2點實例:流感嗜血桿菌基因組的測序及序列組裝超聲波打斷純化的基因組DNA↓瓊脂糖電泳收集1.6～2.0Kb的區段、純化

↓構建到質粒載體中↓隨機挑選19687個克隆,進行28643次測序,得到可讀順序為11631485bp↓組裝成140個覆蓋全基因組范圍的獨立的順序重疊群,↓當前第31頁\共有39頁\編于星期三\2點

各重疊群間仍有間隙

順序間隙物理間隙

↓↓

載體或宿主菌選用不當而被丟失的順序測序時遺漏的測序解決辦法:通過相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構建文庫當前第32頁\共有39頁\編于星期三\2點4.2限制測序

限制測序：是指將一段染色體區段的DNA序列進行組裝.一些已繪制了遺傳圖與物理圖的微生物基因組測序中也采用這一方法.如高等植物擬南芥基因組的測序完全依據克隆重疊群，先進行各個BAC克隆的隨機測序，再進行序列組裝；

水稻基因組測序計劃采取的策略與此相同.當前第33頁\共有39頁\編于星期三\2點4.3指導測序與序列組裝

建立在基因組圖譜基礎上的”鳥槍法”,即所謂”指導鳥槍法”或”指導測序”。在人類基因組進入測序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下:A構建平均為2Kb的人類基因組質粒文庫,進行雙向測序;B構建平均10Kb的人類基因組質粒文庫,進行雙向測序,讀取2個端部順序;C參考人類基因組圖,特別是大量的STS位標作為基點,進行序列組裝，排成重疊克隆群.當前第34頁\共有39頁\編于星期三\2點先將染色體打成比較大的片段(幾十-幾百Kb),利用分子標記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig),分別測序后拼裝.這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測序拼裝當前第35頁\共有39頁\編于星期三\2點兩種策略的比較鳥槍法策略

指導測序策略不需背景信息構建克隆群(遺傳、物理圖譜)時間短需要幾年的時間需要大型計算機得到的是草圖(Draft)得到精細圖譜當前第36頁\共有39頁\編于星期三\2點4.5其他測序路線重要區域優先測序人們對感興趣的基因或與疾病相關的基因優先測序.如:人類主要組織相容性復合區位于第6號染色體,與人類免疫系統有關，因而優先測序.當前第37頁\共有39頁\編于星期三\2點EST(Expressed