培訓課件食品中大腸菌群的測定演示文稿目前一頁\總數四十六頁\編于八點（優選）培訓課件食品中大腸菌群的測定目前二頁\總數四十六頁\編于八點

一、

目的1、

了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛生檢驗中的意義。

2、練習并掌握大腸菌群的檢驗方法

。目前三頁\總數四十六頁\編于八點二、原理1、大腸菌群大腸菌群系指一群在一定條件下（37℃、24小時）能夠發酵乳糖、產酸產氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。目前四頁\總數四十六頁\編于八點這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。根據進一步的生化鑒定試驗，可將大腸菌群細分為大腸埃希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。另一種說法：（主要由腸桿菌科中埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬的一部分及沙門氏屬的Ⅲ亞屬細菌組成。）目前五頁\總數四十六頁\編于八點2、測定的意義該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中是否有腸道致病菌污染的可能性，具有廣泛的衛生學意義。食品中大腸菌群數系以每1g（或mL）檢樣內大腸菌群最可能數MPN（the

most

probable

number-簡稱MPN）表示目前六頁\總數四十六頁\編于八點3大腸桿菌的生物學特性基本形態：

此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。目前七頁\總數四十六頁\編于八點在普通營養瓊脂上有3中菌落形態：

1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；

3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。培養特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。目前八頁\總數四十六頁\編于八點三

、

材料1、食品樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發酵調味品或其他食品。2、陽性對照菌大腸桿菌

目前九頁\總數四十六頁\編于八點3、

儀器設備除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：恒溫培養箱、恒溫水浴箱、

均質器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養皿、菌落計數器等。目前十頁\總數四十六頁\編于八點

4、培養基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA)、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH)、1mol/L鹽酸（HCL)。目前十一頁\總數四十六頁\編于八點

四、檢驗方法第一法大腸菌群MPN計數法。第二法大腸菌群平板計數法。目前十二頁\總數四十六頁\編于八點試驗流程目前十三頁\總數四十六頁\編于八點第一法大腸菌群MPN計數法

1、樣品的稀釋（1）

固體和半固體樣品稱取25g

樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000r/min-10000r/min均質1min-2min，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min-2min，制成1:10

的樣品勻液。目前十四頁\總數四十六頁\編于八點（2）液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10

的樣品勻液。（3）樣品勻液的pH值應在

之間，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L鹽酸（HCI）調節。目前十五頁\總數四十六頁\編于八點目前十六頁\總數四十六頁\編于八點（4）用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10

樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100

的樣品勻液。目前十七頁\總數四十六頁\編于八點

（5）、根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min

。目前十八頁\總數四十六頁\編于八點

2、初發酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）,36℃±1℃培養24h±2h，觀察倒管內是否有氣泡產生，如未產氣則繼續培養至48h±2h。目前十九頁\總數四十六頁\編于八點記錄在24h和48h內產氣的LST肉湯管數。未產氣者為大腸菌群陰性，產氣者則進行復發酵試驗。

目前二十頁\總數四十六頁\編于八點3、復發酵試驗用接種環從所有48h±2h內發酵產氣的LST肉湯管中分別取培養物l環，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB）肉湯管中，36℃±1℃培養48h±2h

，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。

目前二十一頁\總數四十六頁\編于八點煌綠乳糖膽鹽(BGLB）肉湯管目前二十二頁\總數四十六頁\編于八點4、大腸菌群最可能數（MPN）的報告

根據大腸菌群陽性管數，檢索MPN表（見下頁表)，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。注意：當檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內的數也應相應減少或增加。

目前二十三頁\總數四十六頁\編于八點結果報告：MPN表目前二十四頁\總數四十六頁\編于八點第二法大腸菌群計數法目前二十五頁\總數四十六頁\編于八點大腸桿菌0157顯色培養基上的菌落目前二十六頁\總數四十六頁\編于八點在伊紅美蘭乳糖瓊脂（EMB）上目前二十七頁\總數四十六頁\編于八點大腸菌群在去氧膽酸鈉瓊脂上的典型特征典型菌落為紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環。菌落直徑為2-3mm或更大。目前二十八頁\總數四十六頁\編于八點大腸菌群在結晶紫中性紅瓊脂(VRBA)上典型特征

典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環。菌落直徑為0.5mm或更大。目前二十九頁\總數四十六頁\編于八點大腸桿菌在MFC瓊脂上的典型特征目前三十頁\總數四十六頁\編于八點目前三十一頁\總數四十六頁\編于八點試驗流程目前三十二頁\總數四十六頁\編于八點1、樣品的稀釋按第一法中的稀釋方法進行。目前三十三頁\總數四十六頁\編于八點2、平板計數（1）選取2個～3個適宜的連續稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1mL。同時分別取1mL生理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照。（2）及時將15mL-20mL冷至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL-4mLVRBA

覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36℃±l℃培養18h-24h。目前三十四頁\總數四十六頁\編于八點

（3）平板菌落數的選擇選取菌落數在15-150

之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為0.5mm或更大。

目前三十五頁\總數四十六頁\編于八點結晶紫中性膽鹽瓊脂目前三十六頁\總數四十六頁\編于八點

（4）、證實試驗

從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB

肉湯管內，36℃±1℃培養24h-48h

，觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。

目前三十七頁\總數四十六頁\編于八點2、平板計數

（5）大腸菌群平板計數的報告

經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數。目前三十八頁\總數四十六頁\編于八點例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。目前三十九頁\總數四十六頁\編于八點可疑菌落特點：具有金屬光澤的深紫黑色菌落；不帶或略帶金屬光澤的菌落；中心色較深的淡紫黑色菌落。目前四十頁\總數四十六頁\編于八點三、注意事項1、第一步乳糖膽鹽發酵試驗是樣品的發酵結果，不是純菌的發酵試驗，初發酵陽性管，經過后兩步，有可能成為陰性。只做一步，會有相當多的合格樣品作為不合格處理，應注意。目前四十一頁\總數四十六頁\編于八點

2、膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌的生長，有利于大腸桿菌的生長繁殖。目前四十二頁\總數四十六頁\編于八點

3、接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發酵管。目前四十三頁\總數四十六頁\編于八點

4、大腸菌群菌落在EMB瓊脂上大多呈紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤。應取典型菌落，如無應多取幾個菌落，以免出現假陽性。一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，且革蘭