學習目標和要求掌握解細胞分離和目標產物釋放原理和方法，熟知各種方法優缺點和應用范圍。

生物分離工程細胞破碎專家講座第1頁目錄一、細胞分離（一）、重力沉降（二）、離心沉降（三）、過濾二、細胞破碎與胞內物釋放生物分離工程細胞破碎專家講座第2頁細胞分離－學習關鍵點識記：重力沉降、離心沉降和過濾概念。了解：重力沉降、離心分離與過濾原理、理論；掌握Stokes（斯托克斯）沉降公式

。應用：慣用離心方法及優缺點；利用掌握提升分離效率方法分析決實際問題

生物分離工程細胞破碎專家講座第3頁（一）、重力沉淀1、重力沉淀定義2、重力沉淀理論3、提升重力沉降路徑生物分離工程細胞破碎專家講座第4頁1、重力沉降定義

重力沉降是傳統化工過程中慣用從含有固體顆粒流體中將顆粒分離出來操作。

重力沉降是利用流體與顆粒間密度差，在重力作用下使顆粒與流體之間產生相對運動，從而實現二者分離。

在生物分離過程中，定義中顆粒為細胞、細胞碎片等有形物生物分離工程細胞破碎專家講座第5頁千姿百態微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture生物分離工程細胞破碎專家講座第6頁2、重力沉降理論理論假設細胞或細胞碎片按照球形顆粒處理；顆粒在無限稀釋溶液中進行沉降，顆粒之間無相互干擾

受力分析

球形顆粒重力fg液體浮力fb顆粒運動方向相反阻力

fs生物分離工程細胞破碎專家講座第7頁FbFg

Fsd=2R球形顆粒沉降受力情況生物分離工程細胞破碎專家講座第8頁重力沉降理論重力：浮力：阻力：d,Ps—分別指顆粒直徑（m）和密度（kg.m-3）生物分離工程細胞破碎專家講座第9頁生物分離工程細胞破碎專家講座第10頁重力沉降理論當球形顆粒本身重力與其所受到浮力和阻力到達平衡時，

則生物分離工程細胞破碎專家講座第11頁重力沉降理論當球形顆粒處于滯流區（）時

Stokes公式當球形顆粒處于過渡區（）時

Allen公式當球形顆粒處于湍流區（）時Newton公式生物分離工程細胞破碎專家講座第12頁千姿百態微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture球形顆粒？無限稀釋溶液？生物分離工程細胞破碎專家講座第13頁3、提升重力沉降路徑加入中性鹽：雙電層排斥電位降低加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大絮凝圖引入外力生物分離工程細胞破碎專家講座第14頁（二）、離心沉淀1、離心沉淀定義2、離心沉淀理論3、離心分離方法4、離心分離設備生物分離工程細胞破碎專家講座第15頁1、離心沉降定義離心沉降是利用沉降設備使流體和顆粒旋轉，在離心力作用下，因為顆粒和流體間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產生相對運動，從而使顆粒和流體分離。生物分離工程細胞破碎專家講座第16頁生物分離工程細胞破碎專家講座第17頁生物分離工程細胞破碎專家講座第18頁2、離心沉降理論離心沉降速度

令：生物分離工程細胞破碎專家講座第19頁3、離心分離方法差速離心分級區帶離心差速區帶離心平衡區帶離心生物分離工程細胞破碎專家講座第20頁差速離心分離差速離心是以菌體細胞搜集或除去為目標固液離心分離方法，應用某一特定顆粒沉淀離心力在預定離心時間內得到一部分顆粒沉淀及包含未沉淀顆粒上清液。生物分離工程細胞破碎專家講座第21頁差速離心分離應用實例600g10min15000g10min100000g60min300000g120minnucleiMitochondrialysosomesPlasmamembraneRiosomalsubunitshomogenateFilteredhomogenateSolublepartofcytoplasmSedimentation生物分離工程細胞破碎專家講座第22頁區帶離心分離－前提

在離心管內溶液存在密度梯度。采取事先配好不一樣濃度（密度）梯度介質（蔗糖等），按照濃度從大到小標準，依次層層加入。加入離心管中梯度介質經高速離心或靜置后可形成連續密度梯度。生物分離工程細胞破碎專家講座第23頁操作過程生物分離工程細胞破碎專家講座第24頁區帶離心種類差速區帶離心(速度區帶離心）平衡區帶離心（等密度離心）生物分離工程細胞破碎專家講座第25頁差

速

區

帶

離

心生物分離工程細胞破碎專家講座第26頁差速區帶離心基于顆粒大小、形狀分離梯度液最大密度不能超出所分離顆粒最大密度離心過程中，顆粒不停沉降至其浮力密度與梯度液密度相等動態離心分離方法生物分離工程細胞破碎專家講座第27頁平衡區帶離心生物分離工程細胞破碎專家講座第28頁平衡區帶離心梯度液密度范圍含蓋全部待分離顆粒密度離心過程中，顆粒不停沉降至其浮力密度與梯度液密度相等平衡離心分離方法生物分離工程細胞破碎專家講座第29頁梯度液種類和應用生物分離工程細胞破碎專家講座第30頁細胞分離－區帶離心異同區帶離心種類差速區帶離心平衡區帶離心共同點事先在離心管內用低分子量溶質調配好密度梯度梯度介質慣用蔗糖慣用氯化銫密度梯度最大密度梯度低于最大密度沉降樣品最大密度梯度大于最大密度沉降樣品區帶形成條件依據各個組分沉降系數差異，形成各自區帶依據各組分密度差形成區帶離心條件在最前沉降物質到達管底前停頓，短時間，低速度使各組分沉降到其平衡密度區，長時間，高速度

生物分離工程細胞破碎專家講座第31頁離心方法新進展詳細表現在哪幾個方面？1.固定角轉子垂直管離心法進展使用垂直管轉子成功之例是1980年由B.H.Chung等提升血清脂蛋r白分離SVs方法(即SingleVerticalSpin法,一單次垂直管離心法)，它使對臨床診療意義很大這一分離在實用上成為可能.傳統血清脂蛋白分離用“次序浮選法”(即SF法)，一次分離需時3天，用去驅動壽命1億轉以上。現用垂直管轉子作SVS方法，不連續NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5萬一6.5萬轉/分，0.75-2.5i)時，一次分離成功。生物分離工程細胞破碎專家講座第32頁3.短液柱離心法(Short-Columnmethod)由美國0.M.Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平轉子中人為地使用不加滿離心管來降低液柱高。此法不但降低液柱高以降低離心時間，更主要是使處千液面樣品受到更大離心力從而深入縮短了離心時間，在不降低樣品量和樣品濃度條件下，可把離心時間縮短為常規滿管離心時二分之一或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它們在不加滿離心時也不會變形。生物分離工程細胞破碎專家講座第33頁4.細絕(或細菌)離心洗脫(Flutriator)技術這是美國Beckman企業近年發展一個低速連續洗脫技術，尤其適合用于培養液連續搜集。使用是帶小容量連續離心池JE-6B轉子.其洗脫原理不是在普通轉子中沉降，而是被分離物在離心中“浮選”。用4.2ml離心池可在1小時內從100-1000m!原液中回收10'-10，個細胞。生物分離工程細胞破碎專家講座第34頁2.超速連續離心法超速連續離心轉子是由美國Beckman企業開發，最適合用于病毒純化，從大量組織勻漿中分離亞細胞組織、培養液中細菌搜集，以及污水研究。生物分離工程細胞破碎專家講座第35頁4、離心設備分類分類方法名稱處理量試驗室用離心機，工業用離心機溫度常溫離心機、冷凍離心機轉速低速離心機、高速離心機、超速離心機轉子結構管式、碟式生物分離工程細胞破碎專家講座第36頁慣用離心設備Solids-ejectingdiskbowlcentrifugeofpilotsizeforsterilizablecontainedinstallation

Nozzlemachinewithpressurizedsolidsdischargeforyeastandbacteriaseparation

生物分離工程細胞破碎專家講座第37頁慣用離心設備Decantercentrifuge

Multichamberbowl,verticalcut

生物分離工程細胞破碎專家講座第38頁管式離心設備AdisposablecellseparationinsertPowerfugeTMone-chamberwithscraper生物分離工程細胞破碎專家講座第39頁Tubularbowl生物分離工程細胞破碎專家講座第40頁碟片離心設備(a)Solids-retainingdiskbowl,(b)Radialsolids-ejectingdiskbowl,topfeed.(c)Radialsolids-ejectingdiskbowl,hermeticfeed.(d)Axialsolids-ejectingdiskbowl.(e)Nozzlebowlwithpressurizedsolidsdischarge.(f)Nozzlebowlwithperipheraldischargenozzles.生物分離工程細胞破碎專家講座第41頁生物分離工程細胞破碎專家講座第42頁離心設備比較管式離心機優點結構簡單，轉速和離心力較大缺點沉降面積小、處理能力低；碟式離心機優點轉子中存在隔板以增大沉降面積，處理能力大缺點結構復雜、轉速較低；生物分離工程細胞破碎專家講座第43頁離心機處理能力粒子在徑向上沉降速度

軸向移動速度

完全沉降邊界條件

生物分離工程細胞破碎專家講座第44頁離心機處理能力影響原因

處理樣品特征，如密度、粒徑等溶液特征，如密度、粘度等離心機機械結構，如r1和r2操作條件，ω

生物分離工程細胞破碎專家講座第45頁（三）、過濾1、過濾定義2、過濾受力分析3、提升過濾速度路徑生物分離工程細胞破碎專家講座第46頁1、過濾定義過濾是利用多孔性介質（如濾布）截留固液懸浮液中固體粒子，進行固液分離方法。

過濾本身是一個膜分離技術。在分離細胞、菌體或它們碎片過程中除了沉降分離方法外，過濾技術也是一個常備分離方法。生物分離工程細胞破碎專家講座第47頁2、過濾過程受力分析推進力：過濾操作以壓力差為主要推進力；

阻力：過濾過程阻力來自多孔性過濾介質和介質表面不停堆積形成濾餅

生物分離工程細胞破碎專家講座第48頁過濾速率Q：液體流量A:面積Rm表示介質阻力；Rc表示濾餅阻力；μL為濾液粘度生物分離工程細胞破碎專家講座第49頁恒壓過濾方程Ruth恒壓過濾方程其中，K為Ruth恒壓過濾系數，表示為生物分離工程細胞破碎專家講座第50頁3、提升過濾速度路徑采取絮凝或凝聚方法預處理改變料液性質，降低濾餅阻力加入助濾劑以改變濾餅壓縮性指數，提升過濾速度生物分離工程細胞破碎專家講座第51頁

濾餅傳統過濾cakeConventionalfiltration生物分離工程細胞破碎專家講座第52頁生物分離工程細胞破碎專家講座第53頁生物分離工程細胞破碎專家講座第54頁生物分離工程細胞破碎專家講座第55頁生物分離工程細胞破碎專家講座第56頁二、細胞破碎與胞內物釋放1、概述2、細胞破碎技術分類3、慣用破碎方法介紹生物分離工程細胞破碎專家講座第57頁－學習關鍵點了解：各種細胞破碎方法原理、優缺點及其適用范圍。應用：采取不一樣細胞破碎方法對不一樣細胞進行不一樣程度破碎。生物分離工程細胞破碎專家講座第58頁1、概述（1）細胞結構（2）細胞膜組成（3）影響產物釋放原因生物分離工程細胞破碎專家講座第59頁（1）細胞結構

（真核細胞與原核細胞）動物細胞沒有細胞壁，只有由脂質和蛋白質組成細胞膜植物細胞細胞膜外有一層堅固細胞壁酵母細胞細胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質組成，愈加難以破碎真核細胞原核細胞革蘭氏陽性菌細胞壁由肽聚糖層組成，壁厚約15～50nm，肽聚糖含量為40~90%，細胞壁較革蘭氏陰性菌堅固。革蘭氏陰性菌細胞壁在肽聚糖外側還有分別由（1）脂蛋白和（2）磷脂和脂多糖組成兩層外壁層，外壁層厚度越8～10nm。生物分離工程細胞破碎專家講座第60頁（2）細胞膜組成（A）（B）生物分離工程細胞破碎專家講座第61頁（3）影響產物釋放環境原因在復雜培養基中生長大腸桿菌細胞其破碎較單一培養基中生長大腸桿菌細胞更難；對數生長久細胞會表現得愈加脆弱。從連續培養過程中取得、含有較高比生長速率念珠菌細胞壁愈加脆弱，而搖瓶培養念珠菌體則有愈加充裕機會構建愈加堅固細胞壁。酵母細胞壁厚度和破碎阻力隨年紀增加而增加經常在幼酵母細胞中出現芽痕（Budscars）可引發酵母細胞局部細胞壁強度降低生物分離工程細胞破碎專家講座第62頁2、細胞破碎技術分類細胞破碎目標是釋放出細胞內含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分為機械法和非機械法兩大類。生物分離工程細胞破碎專家講座第63頁細胞破碎技術分類細胞破碎機械破碎高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波破碎非機械破碎物理法滲透壓沖擊、凍結-融化、（超聲波）化學法酸堿處理、化學試劑處理生物法酶溶、自溶、噬菌體生物分離工程細胞破碎專家講座第64頁生物分離工程細胞破碎專家講座第65頁3、慣用細胞破碎方法介紹生物分離工程細胞破碎專家講座第66頁

（1）機械破碎－高壓勻漿細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥桿之間環隙高速（可到達450m/s）噴出后撞擊到碰撞環上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。

生物分離工程細胞破碎專家講座第67頁缺點：這種方法較易造成堵塞團狀或絲狀真菌，較小革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器，質地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適適用該法處理。生物分離工程細胞破碎專家講座第68頁（2）機械破碎－－珠磨珠磨機破碎室內填充有80～85％（v/v）玻璃（密度為2.5g/ml）或氧化鋯（密度為6.0g/ml）微球（粒徑約0.1~1.0mm）。在攪拌槳高速攪拌下微球高速運動，微球與微球之間以及微球和細胞之間發生沖擊和研磨，使懸浮液中細胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。生物分離工程細胞破碎專家講座第69頁缺點：設備是珠后機，在珠波分離器幫助下，珠子被滯留在破碎室內，漿液流出，從而實現連續操作，破碎中，生熱量由夾套中冷卻液帶走。存在問題：操作參數多，普通憑經驗預計而且珠子之間液體損失30％左右。生物分離工程細胞破碎專家講座第70頁（3）機械破碎－－撞擊破碎撞擊破碎原理：細胞懸浮液以噴霧狀高速凍結（凍結速度為數千℃/min），形成粒徑小于50微米微粒子，高速載氣（如氮氣，流速為300m/s）將凍結微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結細胞發生破碎。生物分離工程細胞破碎專家講座第71頁

（4）機械破碎－－超聲波破碎壓電傳感器將電子振蕩器交變電流轉換為聲波。在超聲波作用下液體發生空化作用，空穴形成、增大和閉合產生極大沖擊波和剪切力，使細胞破碎。生物分離工程細胞破碎專家講座第72頁生物分離工程細胞破碎專家講座第73頁缺點：超聲波破碎在試驗室規模應用較普遍，處理少許樣品時操作簡便，液量損失少，不過超聲波產生化學自由基團能使一些敏感性活性物質變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱都有困難。生物分離工程細胞破碎專家講座第74頁－非機械破碎之酸堿處理化學試劑處理酶溶自溶滲透壓沖擊法凍結-融化法生物分離工程細胞破碎專家講座第75頁（5）化學滲透法有些有機溶劑(如苯、甲苯