1植物單細(xì)胞培養(yǎng)意義1.1有利于觀察細(xì)胞個體分裂、分化、生長和繁殖情況；1.2有利于取得純細(xì)胞系；1.3有利于進行細(xì)胞特征、細(xì)胞生長規(guī)律、細(xì)胞代謝過程及其調(diào)整控制規(guī)律等方面研究；1.4有利于生物轉(zhuǎn)化和天然化合物生產(chǎn)。植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第1頁

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植物單細(xì)胞分離技術(shù)2.1從外植體直接分離單細(xì)胞2.2從愈傷組織分離單細(xì)胞2.3經(jīng)過原生質(zhì)體再生法取得單細(xì)胞

植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第2頁2.1從外植體直接分離單細(xì)胞外植體經(jīng)過切割、搗碎或酶解，然后經(jīng)過一定孔徑不銹鋼篩網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞懸浮液。懸浮液中所含完整細(xì)胞數(shù)量較少，但分散性好。植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第3頁2.2從愈傷組織分離單細(xì)胞將愈傷組織進行振蕩培養(yǎng)，使其分散成小細(xì)胞團或單細(xì)胞，然后用適當(dāng)孔徑不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去大細(xì)胞團和殘渣，離心除去小殘渣，得到單細(xì)胞懸浮液。為了增強分散效果，必要時可添加適量果膠酶，使由果膠粘連在一起細(xì)胞分開。植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第4頁2.3經(jīng)過原生質(zhì)體再生法取得單細(xì)胞

外植體、愈傷組織或細(xì)胞團經(jīng)過纖維素酶和果膠酶等作用，除去細(xì)胞壁而取得原生質(zhì)體。原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁外植體愈傷組織單細(xì)胞懸浮液愈傷組織再生植株酶解植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第5頁3植物單細(xì)胞培養(yǎng)方法3.1平板培養(yǎng)法（1960年，Bergman）3.2看護培養(yǎng)法（1954年，Muir）3.3微室培養(yǎng)法（1960年，Jones）植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第6頁1單細(xì)胞懸浮液制備2單細(xì)胞懸浮液密度調(diào)整

3固體培養(yǎng)基配制4單細(xì)胞懸浮液與固體培養(yǎng)基等量混合5暗培養(yǎng)6繼代培養(yǎng)3.1平板培養(yǎng)法程序：

植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第7頁1單細(xì)胞懸浮液制備單細(xì)胞起源：

3.1平板培養(yǎng)法程序：外植體(葉肉細(xì)胞)愈傷組織原生質(zhì)體

植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第8頁2單細(xì)胞懸浮液密度調(diào)整要求：調(diào)整后密度為植板細(xì)胞密度2倍調(diào)整方法：①假如密度過大，加入液體培養(yǎng)基進行稀釋；②假如密度小，經(jīng)過低速離心使細(xì)胞沉降后，再加入適量液體培養(yǎng)基。3.1平板培養(yǎng)法程序：植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第9頁3固體培養(yǎng)基配制

當(dāng)細(xì)胞植板密度過高(104或105個/ml)，使用和在懸浮培養(yǎng)中或愈傷組織培養(yǎng)中成份相同純合成培養(yǎng)基當(dāng)細(xì)胞植板密度過小，細(xì)胞對培養(yǎng)基要求就變得越加復(fù)雜注意：要選擇適合單細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基3.1平板培養(yǎng)法程序：植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第10頁4單細(xì)胞懸浮液與固體培養(yǎng)基等量混合①當(dāng)培養(yǎng)基凝固后，細(xì)胞能均勻分布并固定在很薄一層(1mm)培養(yǎng)基中②在培養(yǎng)皿外對單細(xì)胞做標(biāo)識，便于觀察。3.1平板培養(yǎng)法程序：植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第11頁5暗培養(yǎng)注意：培養(yǎng)期間對細(xì)胞頻繁鏡檢會對細(xì)胞生長產(chǎn)生有害作用，應(yīng)盡可能降低鏡檢次數(shù)。3.1平板培養(yǎng)法程序：植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第12頁6繼代培養(yǎng)

選取生長良好由單細(xì)胞形成細(xì)胞團，能夠取得由單細(xì)胞形成細(xì)胞系。3.1平板培養(yǎng)法程序：植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第13頁

初始植板細(xì)胞濃度對單細(xì)胞培養(yǎng)影響用平板法培養(yǎng)單細(xì)胞或原生質(zhì)體時，常以植板效率來表示。植板效率=每個平板上形成細(xì)胞團數(shù)/每個平板上接種細(xì)胞總數(shù)×100%假如在瓊脂培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中，植板細(xì)胞初始密度為1×104或1×105個/ml，植板后由相鄰細(xì)胞形成細(xì)胞群落常混在一起。假如降低植板密度或完全孤立地培養(yǎng)單細(xì)胞，則可防止這個問題。不過當(dāng)?shù)陀谂R界密度時，細(xì)胞就不能分裂。

原因是什么？？植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第14頁

初始植板細(xì)胞濃度對單細(xì)胞培養(yǎng)影響原因：

植物細(xì)胞生長繁殖需要一定濃度一些內(nèi)源化合物。

植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第15頁

初始植板細(xì)胞濃度對單細(xì)胞培養(yǎng)影響

怎樣培養(yǎng)完全孤立單細(xì)胞？？植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第16頁將生長活躍愈傷組織接種在固體培養(yǎng)基上

3.2看護培養(yǎng)法程序：2在愈傷組織塊上方放置一片面積為1cm2無菌濾紙，濾紙下方緊貼愈傷組織植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第17頁3借助于微型移液管從細(xì)胞懸浮液中提取適量單細(xì)胞懸浮液，然后接種在無菌濾紙上面。

3.2看護培養(yǎng)法程序：4將在濾紙上由單細(xì)胞形成細(xì)胞團轉(zhuǎn)移到新鮮固體培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，取得由單細(xì)胞形成細(xì)胞系。植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第18頁可能原因是：1愈傷組織存在給單細(xì)胞傳遞了一些生物信息2愈傷組織為細(xì)胞生長繁殖提供了一些物質(zhì)條件為何有愈傷組織看護就能進行單細(xì)胞培養(yǎng)？植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第19頁1借助于微型移液管從細(xì)胞懸浮液中提取適量單細(xì)胞懸浮液，置于一張無菌載片上。在這滴培養(yǎng)液四面與之隔一定距離加上一圈石蠟油，組成微室”圍墻”，在圍墻左右兩側(cè)再各加一滴石蠟油，每滴之上置一張蓋片作為微室“支柱”。

3.3微室培養(yǎng)法程序：植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第20頁2將第三張蓋片架在兩個“支柱”之間，組成微室“屋頂”

3.3微室培養(yǎng)法程序：單細(xì)胞懸浮液在微室中4當(dāng)細(xì)胞團長到一定大小時揭掉蓋片，把細(xì)胞團轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第21頁微室培養(yǎng)圖示：1滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液周圍加石蠟油凹穴載玻片旁邊加石蠟油蓋蓋玻片蓋蓋玻片平視圖置培養(yǎng)皿中26～28℃恒溫培養(yǎng)植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第22頁微室培養(yǎng)優(yōu)點：①有利于對細(xì)胞特征研究②有利于對單個細(xì)胞生長、分裂、分化等情況進行全程跟蹤研究。植物單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專家講座第23頁小結(jié)：