BMSCs條件培養(yǎng)基對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的影響,外科論文神經(jīng)干細(xì)胞〔neuralstemcells,NSCs〕是一類分布于神經(jīng)系統(tǒng)，具有自我更新并擁有多向分化潛能的干細(xì)胞，其主要分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞，替代受損的神經(jīng)組織進(jìn)而起到治療脊髓損傷的作用[1-2].骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞〔bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs〕屬于成體干細(xì)胞的一種，不僅具有成骨、成脂等多向分化潛能，還能分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[3],近年來利用BMSCs與NSCs共培養(yǎng)技術(shù)治療脊髓損傷已成為研究熱門。有報(bào)道[4]指出，BMSCs與NSCs共移植治療神經(jīng)損傷療效優(yōu)于單純移植NSCs,講明BMSCs為NSCs的生長(zhǎng)與分化提供了一個(gè)愈加適宜的微環(huán)境。然而，是BMSCs本身還是其分泌的營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)揮了作用仍值得討論。該研究利用富含營(yíng)養(yǎng)因子的BMSCs條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)NSCs,去除BMSCs本身的影響，能夠充分了解BMSCs條件培養(yǎng)基對(duì)NSCs增殖與分化的影響，為BMSCs條件培養(yǎng)基的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材料與方式方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生24h內(nèi)SD大鼠1只，雌雄不限；4~5周齡SD大鼠1只，100~120g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器DMEM/F12培養(yǎng)基〔美國(guó)Gibco公司〕；DMEM低糖、南美胎牛血清〔美國(guó)HyClone公司〕;B-27〔美國(guó)Invitrogen公司〕；表皮生長(zhǎng)因子〔epidermalgrowthfactor,EGF〕、堿性成纖維生長(zhǎng)因子〔basicfibroblastgrowthfactor,bFGF〕〔美國(guó)PeproTech公司〕；小鼠抗大鼠巢蛋白〔Nestin〕抗體、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白〔glialfibrillaryacidicprotein,GFAP〕抗體、小鼠抗大鼠微管相關(guān)蛋白-2〔microtubule-associatedprotein-2,MAP-2〕〔美國(guó)SantaCruz公司〕；小鼠抗大鼠髓鞘堿性蛋白〔myelinbasicprotein,MBP〕〔英國(guó)Abcam公司〕；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、TritonX-100〔北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司〕；CD29-PE、CD90-PE、CD34-FITC、CD44-FITC〔美國(guó)BioLegend公司〕；多聚賴氨酸〔美國(guó)Sigma公司〕；MTT試劑盒、胰酶、免疫熒光稀釋液、多聚甲醛、Hoechst33342、青鏈霉素〔100〕〔上海碧云天生物技術(shù)有限公司〕；山羊血清〔中國(guó)武漢博士德公司〕；ECL顯示試劑盒〔美國(guó)Pierce公司〕；CO2恒溫培養(yǎng)箱〔美國(guó)SHELLAB〕；倒置顯微鏡CKX41〔日本Olympus公司〕；流式細(xì)胞儀〔美國(guó)BDFACSVerseTM〕；熒光顯微鏡DMI6000型〔德國(guó)Leica公司〕。1.2方式方法1.2.1大鼠BMSCs體外分離、培養(yǎng)、鑒定采用本課題組前期的實(shí)驗(yàn)方式方法[5]從大鼠骨髓中分離并培養(yǎng)出BMSCs,取生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs,胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，參照之前的方式方法，行細(xì)胞外表標(biāo)記CD90、CD34、CD29的流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.2.2大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基的制備取第3代生長(zhǎng)良好的BMSCs,待細(xì)胞長(zhǎng)至約90%密度時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，每次5min;參加DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集濃縮上清液，按前期實(shí)驗(yàn)比例配制成NSCs增殖與分化條件培養(yǎng)基。1.2.3大鼠NSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定取新生24hSD大鼠幼鼠，處死后置于75%酒精浸泡5min;在無菌條件下分離出大腦半球，剪碎，參加0.25%胰酶消化10min,輕輕吹打混勻后經(jīng)篩網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液；參加增殖培養(yǎng)基〔DMEM/F12+2%B27+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+鏈霉素0.1mg/ml+青霉素100U/ml〕，600r/min離心5min2次，棄上清液；吹打混勻后以3105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d半定量換液1次，培養(yǎng)7d后傳代。取第2代培養(yǎng)7d的細(xì)胞球，600r/min離心5min,棄上清液，接種于經(jīng)0.1mg/ml多聚賴氨酸包被蓋玻片的6孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱6h,使懸浮干細(xì)胞貼壁。用PBS洗滌3次，每次5min;4%多聚甲醛固定后，PBS洗滌3次，每次5min.在含0.3%TritonX-100中孵育10min,PBS洗3次后，參加正常山羊血清封閉液，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h后，參加1∶50稀釋Nestin一抗，4℃條件下孵育過夜。次日常溫下放置2h,PBS洗滌3次，每次5min,參加1100稀釋FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1h.最后行Hoechst溶液核染后封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。1.2.4大鼠NSCs分化及分化后鑒定取第2代培養(yǎng)7d的NSCs球，600r/min離心5min,棄上清液；參加分化培養(yǎng)基〔DMEM/F12+2%B27+鏈霉素0.1mg/ml+青霉素100U/ml+10%FBS〕，吹打混勻后，接種于經(jīng)0.1%多聚賴氨酸包被蓋玻片的6孔板中；置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，每3d半定量換液1次。1周后，參照上述免疫熒光方式方法，行神經(jīng)元特異性蛋白MAP-2、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白MBP的免疫熒光染色。1.2.5大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基在增殖情況下對(duì)大鼠NSCs增殖的影響取第2代培養(yǎng)7d生長(zhǎng)良好的NSCs,600r/min離心5min,吹打均勻。實(shí)驗(yàn)組換用BMSCs條件培養(yǎng)基在增殖條件下放入96孔板中培養(yǎng)，每孔細(xì)胞數(shù)約2104個(gè)，對(duì)照組放入96孔板中繼續(xù)增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1、3、5d時(shí)，每次每組取6孔行MTT檢測(cè)，利用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制，了解大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基在增殖條件下對(duì)NSCs的影響。MTT檢測(cè)：每孔參加510-3g/ml的MTT溶液20l,置于37℃溫箱4h后取出，棄上清液；每孔參加DMSO150l,振蕩10min混勻后，用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度〔opticaldensity,OD〕值；每個(gè)樣品取6孔，算出平均值后繪制曲線。另外，取第2代培養(yǎng)7d生長(zhǎng)良好的NSCs接種至6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1106,培養(yǎng)方式方法同上，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。在培養(yǎng)第5天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照每組取3孔，在顯微鏡下〔100〕，根據(jù)雙盲法，每次每組各取10個(gè)視野對(duì)NSCs球進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)每組選取10個(gè)細(xì)胞球利用ImageJ圖像處理軟件測(cè)量其直徑〔直徑的最大值/2+最小值/2〕。1.2.6大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基在分化情況下對(duì)大鼠NSCs分化的影響取第2代培養(yǎng)7d的NSCs球，600r/min離心5min,棄上清液，重懸后計(jì)數(shù)，接種于經(jīng)0.1%多聚賴氨酸包被蓋玻片的6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約1106.實(shí)驗(yàn)組換用大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基在分化條件下培養(yǎng)，對(duì)照組在無條件培養(yǎng)基條件下分化。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，每3d半定量換液1次。1周后，分別提取分化后細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度選擇上樣量，依次行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；加一抗于4℃孵育過夜，次日洗膜，參加相應(yīng)蛋白二抗，室溫孵育2h,充分洗滌后顯影、定影。所使用抗體及稀釋度：MAP-2〔小鼠單抗，1∶200稀釋〕，GFAP〔兔多抗，1∶500稀釋〕，MBP〔小鼠單抗，1∶500稀釋〕，-ac-tin〔小鼠單抗，