基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中應(yīng)用劉敬忠首都醫(yī)科大學從屬北京朝陽醫(yī)院北京基因診療試驗室

北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法判定所臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第1頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第2頁中心法則復

轉(zhuǎn)錄翻譯

DNA

RNA

蛋白質(zhì)

蛋白

制

反轉(zhuǎn)錄

糖蛋白脂蛋白酶類激素細胞因子

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第3頁基因重組技術(shù)

基因探針技術(shù)

基因重組藥品基因診療基因治療

PKU尿毒癥（口服artificialcells)臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第4頁基因診療

利用基因探針，PCR技術(shù)等探測特定靶基因存在是否，或是否有基因突變等缺點，從而對疾病或病原體感染作出診療叫基因診療。

基因型表型基臨血生細影病因床清化菌像理診學學學學學斷診診診診診診斷斷斷斷斷斷臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第5頁基因診療特點靈敏度高（早期）特異性強操作簡便取材大多不受組織器官限制可進行早期診療，癥狀前診療及產(chǎn)前診療檢測細菌內(nèi)病毒等微生物時不需培養(yǎng)臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第6頁聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction（PCR）KaryB.Mullis1984年問世,成為分子生物學和生命科學發(fā)展史上里程碑1993榮獲諾貝爾獎Mendocin128號公路附近一棵七葉樹下突發(fā)奇想專利官司之戰(zhàn):DuPont與Cetus對薄公堂臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第7頁

PCR原理示意圖臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第8頁PCR技術(shù)應(yīng)用一、在分子生物學研究中應(yīng)用二、遺傳病基因診療和產(chǎn)前基因診療：血友病、地中海貧血、DMD、PKU等等三、細菌、支原體、衣原體、立克次體等四、病毒五、白血病、腫瘤六、骨髓移植、器官移植供體配型選擇七、法醫(yī)學八、動植物學九、古人類學、古生物學

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第9頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第10頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第11頁PCR原理示意圖臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第12頁熱變性：從外周血白細胞或絨毛、羊水細胞提取DNA約1ug，在含有適當緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等反應(yīng)混合物中，在94℃下熱變性4分鐘，使之解為單鏈。

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第13頁退火：然后置反應(yīng)混合物于55℃，使引物與解為單鏈DNA上互補序列雜交在一起，稱之為退火。并快速加入2單位耐熱TaqDNA聚合酶，混勻、離心10秒鐘。為預防在整個PCR過程中，水份蒸發(fā)影響PCR效果，通常加入35ul石蠟油封蓋液面。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第14頁引物延伸：置上述反應(yīng)混合物于70℃水浴中1-2分鐘，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物3’端A開始,沿著5’→3’方向，合成每條模板互補鏈，此稱引物延伸。結(jié)果，DNA拷貝數(shù)增加了一倍。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第15頁接著，將上述熱變性—退火—引物延伸（稱為一個循環(huán)）重復進行30-35次。只是熱變性時間縮短為1分鐘左右。每經(jīng)過一個循環(huán)，DNA拷貝數(shù)便增加一倍（×2）。所以，如進行n次循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加2n倍！進行25個循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加225倍，即上百萬倍。在瓊脂糖凝膠電泳上可看到特異性長度擴增帶。可見PCR之所以高速擴增關(guān)鍵是因為每次新合成DNA鏈在以后循環(huán)中都能夠作模板，如同滾雪球，數(shù)量快速增加。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第16頁假如引物5’端有幾個與模板DNA不配正確堿基，仍可能與模板DNA退火、延伸，對PCR效果影響不大。這一特點，可使PCR產(chǎn)物兩端帶上限制酶Linker，或造成DNA次序缺失、插入、堿基替換等。大大增大了PCR技術(shù)應(yīng)用范圍。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第17頁影響PCR效果主要原因及注意事項：PCR技術(shù)原理似乎非常簡單明了，PCR反應(yīng)操作也并不復雜；但要取得好結(jié)果和良好可重復性并非易事。必須徹底弄通其分子生物學奧妙之處，并把握其各種影響原因，規(guī)范操作。以以下出影響PCR擴增效果主要原因臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第18頁引物設(shè)計一定要科學合理，序列特異性要高。長度普通在18-25個堿基，Tm值可按公式（G+C總數(shù)x4）+（A+T總數(shù)x2）（℃）估算。盡可能避開4個以上G或C等相同堿基串聯(lián)重復。盡可能防止引物內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間形成二聚體（Dimer）可能性。G、C與A、T百分比盡可能1:1左右。同一反應(yīng)管中引物（甚至同一個Lab全部引物）Tm值設(shè)計相同。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第19頁引物在反應(yīng)體系中濃度要經(jīng)過優(yōu)化。雙重PCR及多重PCR對各引物濃度間百分比要求更嚴。基因組DNA制備液純度要好。其用量也并非越多越好。各種試劑小量分裝保留，防止屢次凍融。dNTP濃度要優(yōu)化。

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第20頁退火溫度參考Tm值進行優(yōu)化。其對PCR成敗，非特異產(chǎn)物出現(xiàn)是否關(guān)系最大。TaqDNA聚合酶廠牌、批號和用量均要適當。對擴增難度較大PCR，Mg2+濃度要適當增加。操作者手法也有影響，要在實踐中總結(jié)提升技術(shù)。

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第21頁熒光定量PCR行HLA-DrB1位點分型法建立及與血清學方法比較臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第22頁HLA分型技術(shù)HLA（人類白細胞抗原）MHC區(qū)基因（主要組織相容性復合物基因區(qū)）高度多態(tài)性基因區(qū)臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第23頁HLA分型技術(shù)一、淋巴細胞微量細胞毒試驗1964年，PaulTerasaki,LA,USA二、DNA分型法優(yōu)點：1.血樣不要求新鮮;2.白血病患者WBC表面抗原被破壞,只能用DNA分型法;3.結(jié)果更準確可靠臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第24頁HLA分型技術(shù)DNA-RPLP,1982PCR/SSOPCR/反向斑點雜交PCR/SSCPPCR/SSPPCR/SBTR-Q-PCR/SSPPCR/dHPLC等臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第25頁

在序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）技術(shù)基礎(chǔ)上，將熒光定量PCR（FQ-PCR）技術(shù)與SSP結(jié)合起來，建立了自動化程度更高熒光定量PCR-HLA分型技術(shù)，完成了46例尸腎供受者HLA-DBR1分型。FQ-PCR不需走電泳，降低了污染機會，提升了自動化程度。同時又開展了以DNA測序為基礎(chǔ)HLA分型（SBT）技術(shù)。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第26頁三、主要方法：1、HLA血清學分型。2、常規(guī)PCR-SSP反應(yīng)。3、SBT分型法：

(1)PCR擴增DRB1片段。

(2)用ABI-373型自動測序儀測序。

(3)測序數(shù)據(jù)分析及分型。

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第27頁結(jié)果和討論一、進行PCR-SSP法HLA-DRB1位點分型：臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第28頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第29頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第30頁4、熒光定量PCR技術(shù)原理：

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第31頁圖3、熒光定量PCR中反應(yīng)前模板濃度與Ct值成反比臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第32頁圖4、15R-II號樣本熒光定量分型結(jié)果臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第33頁圖5、SSP分型結(jié)果與上述一致臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第34頁FQ-PCR分型優(yōu)點：

(1)熒光定量分型法省去了電泳分析、UVP成像操作，簡化步驟，提升自動化程度，降低了工作量。

(2)判讀結(jié)果與擴增由儀器同時完成，節(jié)約了PCR后處理時間，結(jié)果更客觀。

(3)將引物特異性和探針特異性結(jié)合，提升了準確性。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第35頁(4)只需在反應(yīng)前打開離心管一次，即可完成全部操作，降低了污染機會，深入提升了特異性和靈敏性。(5)本FQ-PCRHLADRB1配型較常規(guī)FQ-PCR降低了合成熒光探針數(shù)量。(6)可得出起始模板拷貝數(shù)定量結(jié)果。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第36頁基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中應(yīng)用特點：PCR技術(shù)一問世，首先就應(yīng)用于β—珠蛋白生成障礙性貧血等遺傳病基因診療。不但要查特定基因是否存在，而且要查出對應(yīng)功效基因缺點：突變？缺失？插入？倒位？等等。采取技術(shù)更復雜、多樣，與檢測病毒、細菌要求不完全相同。試驗室驗收。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第37頁基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中應(yīng)用技術(shù)：PCR/凝膠電泳PCR/RFLPPCR/SSCPPCR/ASO(Allile-specificoligoprobe)PCR/sequencingASA(Allile-specificAmplification)m-PCR(multiplexPCR)F-Q-PCR(Real-TimePCR)臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第38頁血友病甲基因診療劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白，朱章菱，周艷，劉亮，張晶首都醫(yī)科大學從屬北京朝陽醫(yī)院北京基因診療試驗室北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法判定所臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第39頁甲型血友病Ⅷ因子基因倒位研究及檢測新技術(shù)：

血友病甲（HA）是常見X-連鎖遺傳性出血性疾病，是因為凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因缺點所致。約半數(shù)重型HA患者，是因為FⅧ基因第22內(nèi)含子（IVS22）發(fā)生基因倒位所致。迄今，國際上檢測這種基因倒位都是用Southern印跡雜交技術(shù)。即使這種技術(shù)能夠準確查出這種基因倒位，但操作步驟多，流程長，出結(jié)果慢，難度大，需要DNA樣品量大以及操作放射性同位素標識探針等。我們從1996年開始在國際上率先研究利用長距離DNA擴增技術(shù)（LD-PCR），替換Southern雜交進行FⅧ基因倒位診療。經(jīng)過近二年努力終獲成功，并進行了推廣應(yīng)用。主要完成了以下幾方面工作：臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第40頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第41頁自行設(shè)計合成了長距離PCR四個引物P、Q、A、B。預期擴增產(chǎn)物長度P/Q為12Kb，A/B為10Kb，P/B及A/Q為11Kb。

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第42頁四引物及三引物LD-PCR體系比較臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第43頁

系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量，deaza-dGTP百分比，DMSO濃度，基因組DNA質(zhì)量和用量，退火及延伸溫度、時間，低濃度瓊脂糖凝膠電泳條件及操作方法等。使10-12KbDNA擴增及檢測倒位終獲成功。這充分表達了該結(jié)果科學性和先進性臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第44頁不一樣量模板DNA對LD-PCR影響

1--5號DNA量分別為0.25，0.5，0.75，1.0，1.25μg臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第45頁不一樣量deaza-dNTP對LD-PCR影響

1--5號dNTP濃度分別為200，300，400，500，

600μM臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第46頁

53份重型HA患者及家系組員DNA標本，分別用經(jīng)典Southern印跡雜交和本LD-PCR技術(shù)在雙盲條件下進行FⅧ基因倒位檢測。二者得出診療結(jié)論完全一致。表明用LD-PCR技術(shù)診療該基因倒位，檢出攜帶者特異性和靈敏度均到達百分之百。而且含有操作步驟較簡便，需DNA量少，出結(jié)果快，不需操作放射性同位素標識探針，在無法取得先癥者患兒血樣情況下，也可直接查攜帶者是否攜帶倒位基因，假如是可直接做產(chǎn)前診療等優(yōu)點。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第47頁雙盲試驗（53份DNA）結(jié)果證實：LD-PCR可獨立用于重型HA基因倒位檢測臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第48頁應(yīng)用試驗成功LD-PCR技術(shù)，對來自北京、天津、江蘇、湖北、廣西、四川、山東、福建等省市108個重型HA患者及數(shù)目不等家系組員進行了檢測，共查出FⅧ基因倒位47例，占44%，與國際上用Southern雜交技術(shù)查出基因倒位引發(fā)HA約占重型HA40-50%一致。另外，檢出30余位倒位基因攜帶者，為未來開展產(chǎn)前基因診療，杜絕新HA患兒出生打下了基礎(chǔ)，對優(yōu)生、提升人口素質(zhì)有主要意義。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第49頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第50頁14個DNA標本LD-PCR電泳結(jié)果

M：λDNA/HindⅢ酶解產(chǎn)物，三條帶分別為23.1kb，9.4kb，6.6kb臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第51頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第52頁美國Steve.S.Sommer去年與我們同期發(fā)表了一篇類似技術(shù)方法摘要文章。但我們較他們有兩個顯著不一樣特點：一是我們強調(diào)了利用P、Q和B這三個引物就完全能夠滿足診療需要，省去一個引物A，降低一條10Kb擴增帶。這條10Kb帶是多出，且使11Kb及12Kb帶出現(xiàn)難度增大。二是我們研究成功方法后，馬上快速應(yīng)用于患者及其家系診療和攜帶者檢出，現(xiàn)已達一百余家系，產(chǎn)生了很大社會效益和一定經(jīng)濟效益，并開始向弟兄單位推廣應(yīng)用。臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第53頁

HA8家系PCR/BclⅠ酶解分析結(jié)果

M:pBR322/MspⅠ；0:Ⅱ-2（酶解前）擴增帶長374bp，圖中211bp和163bp為酶解后產(chǎn)物

MⅡ3Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ1Ⅱ20

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第54頁

HA15家系St14位點VNTR多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果

M:ΦX174/HaeⅢ

MⅡ1Ⅱ2Ⅱ3Ⅰ2Ⅰ1臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第55頁HA18家系內(nèi)含子13（A）和內(nèi)含子22（B）可變串聯(lián)重復數(shù)目多態(tài)性分析結(jié)果

A為內(nèi)含子13中（CA）重復分型結(jié)果：Ⅰ-1為21/-，Ⅱ-2為21/20，Ⅰ-2為22/20，Ⅱ-1為21/-，Ⅲ-1為21/21，她是攜帶者；B為內(nèi)含子22中（GT）（AG）重復分型結(jié)果：Ⅰ-1為26/-，Ⅱ-2為26/26，Ⅰ-2為27/26，Ⅲ-1為26/25，Ⅱ-1為25/-

Ⅰ1Ⅱ2Ⅰ2Ⅲ1Ⅱ1臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第56頁血友病乙基因診療，攜帶者檢出和產(chǎn)前診療劉敬忠首都醫(yī)科大學從屬北京朝陽醫(yī)院北京基因診療試驗室北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法判定所臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第57頁血友病乙基因診療，攜帶者檢出和產(chǎn)前診療臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第58頁缺失型α-地中海貧血基因診療技術(shù)改進劉敬忠，周桔，王立榮，周艷首都醫(yī)科大學從屬北京朝陽醫(yī)院北京基因診療試驗室北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法判定所臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第59頁臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第60頁臨床診療Bart’s（--/--）基因型臨床分型靜止型（-/）--SEA-3.7-4.2標準型（--/）HbH病（--/-）臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第61頁

問題：PCR技術(shù)可重復性差,難度大，

結(jié)果判斷復雜，

引物設(shè)計有待改進

辦法：1、重新設(shè)計引物

2、改進和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

酶、deaza-dGTP、DMSO、

退火溫度、gradientgel等

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第62頁A’B’C’A’B’C’G’ES1S2S3M1123456M2789M2101112M31.2%/2.0%濃度梯度瓊脂糖凝膠1，4，正常（αα/αα）；2，5，-3.7/αα；3，6，-3.7/--SEA；7，αα/αα；8，-4.2/αα；9，12，-4.2/--SEA；10，αα/αα；11，--SEA/--SEA；12，9，-4.2/--SEA1.58Kb287bp173bp1.9Kb1.7Kb

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第63頁依據(jù)本試劑盒三個PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜作出基因診療臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第64頁單管四重PCR試劑盒檢測α-珠蛋白基因三種缺失類型及引物設(shè)計示意圖

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第65頁10種DNA四重PCR圖譜臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第66頁25個海南黎族人DNA擴增圖譜臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第67頁

20個廣西、廣東α-地貧68標本多重PCR擴增圖臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第68頁依據(jù)圖譜作出診療擴增帶電電泳圖

及診療序號0.8Kb1.6Kb1.9Kb1.5Kb診斷1--+-正常(αα/αα);但不排除αα/αTα可能性2-++--α3.7攜帶者(-α3.7/αα)3--++-α4.2攜帶者(-α4.2/αα)

4-+---α3.7純合子(-α3.7/-α3.7)

5---+-α4.2純合子(-α4.2/-α4.2)6-+-+-α3.7/-α4.2雙重雜合子

7+-----SEA/--SEA巴氏水腫胎兒

8++----SEA/-α3.7(缺失型HbH病)

9+--+--SEA/-α4.2(缺失型HbH病)

10+-+---SEA/αα（--SEA攜帶者）--SEA/αTα(非缺失型HbH病)

11----PCR失敗,查找原因,重復作

臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第69頁DNA提取方法：鹽析法酚-氯仿抽提法Chelex快速法臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第70頁0.8kb質(zhì)粒靈敏度檢測臨檢培訓基因擴增技術(shù)在遺傳病基因診療中的應(yīng)用第71頁0.8kb穩(wěn)定性結(jié)果:1#-a3.7/--2#-a4.2/--3#aa/--4#-a3.7/-a4.25#aa/--0小時48小時72小時