轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

---轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建2010.05.204/10/20231基因打靶的簡(jiǎn)易程序4/10/20232優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法4/10/20233主要是利用反轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的特點(diǎn),將外源基因連接到LTR下游進(jìn)行基因重組后,再包裝成為高滴度病毒顆粒,去直接感染受精卵或顯微注入囊胚腔中,攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法4/10/202353、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法優(yōu)點(diǎn)由于反轉(zhuǎn)錄病毒的高效率感染和在宿主細(xì)胞DNA中的高度整合特性,大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運(yùn)載至細(xì)菌中擴(kuò)增和表達(dá)。病毒載體是較理想的真核基因工程載體缺點(diǎn)獲得純合體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的機(jī)會(huì)少病毒載體構(gòu)建復(fù)雜轉(zhuǎn)入的外源基因的大小受到限制,<10kb轉(zhuǎn)入病毒自身基因的復(fù)制表達(dá)4/10/202364、體細(xì)胞核移植法首先將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到體外培育的動(dòng)物體細(xì)胞中,篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并進(jìn)行繁殖,制備出供移植用的細(xì)胞核供體。然后將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核供體移植到去核的卵母細(xì)胞中,重構(gòu)胚胎經(jīng)過(guò)激活和培養(yǎng)后,移植到代孕小鼠中1997年,英國(guó)Roslin

研究所的Wilmut等利用成年綿羊乳腺上皮細(xì)胞作為核供體,成功獲得了體細(xì)胞克隆綿羊多莉(Dolly),拉開(kāi)了動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)的序幕。4/10/20237優(yōu)點(diǎn)減少受體動(dòng)物的數(shù)目,不需要用受體母畜來(lái)承擔(dān)那些非轉(zhuǎn)基因的胚胎,表現(xiàn)了強(qiáng)大的生命力。事先在細(xì)胞中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行篩選,簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的許多環(huán)節(jié),節(jié)約了人力,具有很大的優(yōu)越性。缺點(diǎn)體細(xì)胞克隆技術(shù)近年來(lái)發(fā)展勢(shì)頭十分迅猛,但在基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上還需進(jìn)一步探索。4、體細(xì)胞核移植法4/10/202395、精子載體法將精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之后,使精子有能力攜帶外源基因進(jìn)入卵中,受精后進(jìn)行胚胎移植,這樣產(chǎn)生的動(dòng)物也會(huì)使外源基因得到表達(dá)。精子攜帶DNA的途徑 外源DNA與精子共孵育 電穿孔導(dǎo)入法 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法4/10/202310優(yōu)點(diǎn)基因轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)便,效率高動(dòng)物育種不經(jīng)過(guò)嵌合體,實(shí)驗(yàn)周期短缺點(diǎn)目的基因整合的隨機(jī)性無(wú)法早期驗(yàn)證修飾事件成功率不高、效果不穩(wěn)定5、精子載體法4/10/2023117、BAC法（人工細(xì)菌染色體法）建立在大腸桿菌的F因子上的BAC載體：外源DNA可>300kb。F因子（F質(zhì)粒）是一種“性質(zhì)粒”，可轉(zhuǎn)移至F-宿主細(xì)胞。100kb,近百個(gè)蛋白質(zhì)。可構(gòu)建BAC文庫(kù)；有單一的loxp位點(diǎn)，利于圖譜分析（借助標(biāo)記loxp和cre

重組酶；

BAC載體兩端有Sp6和T7引物序列利于測(cè)序，確定基因的染色體定位；可穩(wěn)定遺傳，易于操作。BAC文庫(kù)：基因組酶切后100～300kbDNA+BAC大腸桿菌4/10/202313方法顯微注射核移植胚胎干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒基因敲除精子介導(dǎo)優(yōu)點(diǎn)外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長(zhǎng)度可達(dá)100Kb轉(zhuǎn)基因效率高；預(yù)測(cè)基因表達(dá)水平；可以使用定點(diǎn)整合技術(shù)外源DNA的整合率高；

整合在生殖細(xì)胞中的比例也很高。

可在整合點(diǎn)整合轉(zhuǎn)移基因的單個(gè)拷貝；該方法簡(jiǎn)單、方便缺點(diǎn)精密儀器，技術(shù)操作較難，易造成宿主動(dòng)物基因組的插入突變供體細(xì)胞易衰老ES細(xì)胞株不易建立，長(zhǎng)期培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是嵌合體

插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA在動(dòng)物各種組織中的分布不均

應(yīng)用具有一定局限性有些結(jié)果不能重復(fù)

基因轉(zhuǎn)移方法的比較4/10/202314Electroporation4/10/2023154/10/2023174/10/2023184/10/2023191256434/10/2023214/10/2023224/10/202323

轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

---轉(zhuǎn)基因小鼠在科研中的應(yīng)用4/10/2023251.

7500萬(wàn)－1.25億年前--人鼠始祖小鼠的歷史2.

19世紀(jì)--寵物鼠---實(shí)驗(yàn)鼠的“先驅(qū)”3.

1897年--重組表型

4/10/2023268.

1921年--C57BL株系基因組測(cè)序在2002年完成小鼠的歷史9.

1929年--Jackson實(shí)驗(yàn)室---世界上最重要的小鼠遺傳學(xué)研究中心在Hudson汽車公司的頭目EdselFord和RoscoeJackson兩位大財(cái)主的資助下，CharenceLittle在美國(guó)緬因州BarHarbor建立了Jackson實(shí)驗(yàn)室4/10/20232910.

1953年--DNA雙螺旋Crick，Watson和Wilkins三人因?yàn)檫@項(xiàng)杰出的成就榮獲了1962年的諾貝爾獎(jiǎng)。11.

1966年--遺傳密碼破譯

RobertHolly，HarGobindKhorana和MarshallNirenberg破譯了遺傳密碼---1968年的諾貝爾獎(jiǎng)

小鼠的歷史4/10/20233012.

1972年---小鼠遺傳學(xué)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)

Jackson實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了第一個(gè)哺乳動(dòng)物遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)13.

1977年--Sanger測(cè)序法和同事WalterGilbert分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)---人類和小鼠基因組測(cè)序過(guò)程中的主要技術(shù)14.

1982年--轉(zhuǎn)基因小鼠

小鼠的歷史4/10/20233116.

1987-89年--第一只基因敲除小鼠

MartinEvans，OliverSmithies和MarioCapecch領(lǐng)導(dǎo)的幾個(gè)研究小組---2001獲得了Lasker獎(jiǎng)17.

1996年--“百慕大法則”

公共基因組序列數(shù)據(jù)18.

1998年

--克隆鼠

1997年克隆羊“多莉”誕生之后，夏威夷的一個(gè)小組培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹們。15.

1983年--PCR

KaryMullis--1993年的諾貝爾獎(jiǎng)

小鼠的歷史4/10/20233219.

1999年--小鼠基因組測(cè)序協(xié)會(huì)人類基因組三個(gè)主要測(cè)序中心（TheWellcomeTrustSangerInstitute,TheWhiteheadCenterforGenomeResearch和WashingtonUniversityGenomeSequencingCenter）成立了一個(gè)相互協(xié)作的小鼠基因組測(cè)序機(jī)構(gòu)，取名為小鼠基因組測(cè)序協(xié)會(huì)（MouseGenomeSequencingConsortium,MGSC)20.

2001年2月--人類基因組

21.

2001年6月--散彈法美國(guó)公司CeleraGenomics使用散彈法測(cè)得了用于銷售的小鼠序列草圖。散彈法是一種一次性測(cè)得基因組全序列的技術(shù)。小鼠的歷史4/10/20233322.

2002年5月--16號(hào)染色體與已被分析的人類

21號(hào)染色體序列高度相似23.

2002年8月--小鼠基因組物理圖譜

24.

2002年12月

--小鼠基因組小鼠基因組測(cè)序協(xié)會(huì)發(fā)表了一份高質(zhì)量的小鼠基因組序列草圖，并且同時(shí)對(duì)C57BL/6J小鼠株系做了分析。這個(gè)基因組大小約為2.5Gb，比人類基因組要小，預(yù)計(jì)的基因也少于30000個(gè)。約有40%的小鼠和人類基因組序列相高度似性，80%的人類基因在小鼠基因組中能找到相應(yīng)的基因。同時(shí)還有不少文章對(duì)小鼠遺傳組成的其它方面做了詳細(xì)討論。在日本RIKEN基因組科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的努力下，很多相關(guān)的重要資源都能夠被免費(fèi)獲取。

小鼠的歷史4/10/202334轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的應(yīng)用基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究基因工程定向育種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制人類疾病小鼠模型與基因治療藥理學(xué)研究器官移植環(huán)境科學(xué)研究4/10/202335基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究Hoxgene(同源異形盒基因）疾病基因?qū)W習(xí)與記憶基因生理周期基因基因表達(dá)有時(shí)空與組織的特異性；外源基因的表達(dá)受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；4/10/202336基因工程定向育種向動(dòng)物體轉(zhuǎn)移外源基因并使之在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，能夠克服物種間固有的生殖隔離，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物育種之間遺傳物質(zhì)的交換。實(shí)質(zhì)是將基因轉(zhuǎn)移與傳統(tǒng)育種方法結(jié)合，各取其精華，快速創(chuàng)造新的目的變異和固定擴(kuò)展變異，從而快速培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗逆動(dòng)物品種。轉(zhuǎn)基因羊、豬、雞、魚、鼠等4/10/202337轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器概念：將具某種重要應(yīng)用價(jià)值的生物活性蛋白基因?qū)雱?dòng)物受精卵或早期胚胎，培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使外源基因在動(dòng)物的特定組織內(nèi)高效表達(dá)，再?gòu)倪@些組織的分泌液、浸出液或血清中分離提取目的基因產(chǎn)物。乳腺---理想器官腎臟和膀胱多肽藥物、蛋白質(zhì)疫苗、酶類細(xì)菌-動(dòng)物細(xì)胞-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物4/10/202338乳腺生物反應(yīng)器具有以下特點(diǎn)：

⑴乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達(dá)的蛋白質(zhì)不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物本身的影響；

⑵乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器；

一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250—300Kg，一只綿羊或山羊 一年可生產(chǎn)乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代 換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。

⑶乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達(dá)的蛋白經(jīng)過(guò)充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性接近天然產(chǎn)品；

⑷在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖生產(chǎn)群體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制4/10/202339轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制乳腺組織特異表的基因：具milkbox保守序列----乳清蛋白基因 ----b乳球蛋白基因 ----酪蛋白基因已開(kāi)發(fā)的產(chǎn)物： ----血栓治療藥物（組織型纖溶酶原激活因子)----出血性疾病（凝血因子VIII，IX） ----免疫治療藥物（IFN，IL，TNF） ----營(yíng)養(yǎng)制劑(人乳鐵蛋白）4/10/202340人類疾病小鼠模型與基因治療癌癥---肺癌---p53功能缺陷遺傳病---地中海貧血（臨床失敗---細(xì)胞表達(dá)？）AD

---對(duì)AD患者死亡后腦部解剖發(fā)現(xiàn)腦部存積了一種β淀粉狀蛋白

----將人類β淀粉狀蛋白的基因轉(zhuǎn)到大鼠體內(nèi)使其發(fā)病，再清除β淀粉狀蛋白，發(fā)現(xiàn)能夠減慢甚至停止病情4/10/202341藥理學(xué)研究胰島b細(xì)胞B7-1轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)STZ敏感阿霉素抗癌，但心臟毒性等副作用大

---金屬硫蛋白MT具保護(hù)作用P糖蛋白---腫瘤多藥耐藥

---knockoutmice證實(shí)其影響藥物的分布與清除4/10/202342器官移植超急性排斥反應(yīng)補(bǔ)體激活的阻斷---免疫抑制劑危險(xiǎn)補(bǔ)體活性調(diào)節(jié)因子的負(fù)調(diào)控 ---膜輔助因子MCP ---衰退促進(jìn)因子hDAP/hCD591999---豬心—獼猴（器官大小）4/10/202343環(huán)境科學(xué)研究生物可利用性的分析只能在活體研究毒理/環(huán)境基因組學(xué)轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)---HSP16/lacZ4/10/202344轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的主要問(wèn)題外源基因的整合率低外源基因的表達(dá)不理想成本高轉(zhuǎn)基因給動(dòng)物造成插入突變和機(jī)能紊亂轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成活率低轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品的安全性改善外源基因轉(zhuǎn)移方法定點(diǎn)整合-cre/loxp組織特異性啟動(dòng)子生態(tài)/遺傳/食品安全結(jié)合動(dòng)物克隆技術(shù)--Dolly&Polly4/10/2023454/10/202346參考文獻(xiàn)現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)---科學(xué)出版社，林菊生主編精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南---科學(xué)出版社，顏?zhàn)臃f/王海林譯小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)手冊(cè)---化學(xué)工業(yè)出版社，孫青原/陳大元譯基因工程小鼠---上海科學(xué)技術(shù)出版社，傅繼梁主編Transgenicmouse-meth