植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理及要點(diǎn)第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五1.技術(shù)路線目的基因分離植物表達(dá)載體的構(gòu)建受體材料的準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化組織組織脫分化轉(zhuǎn)化植株篩選煉苗第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五1.目的基因的分離（1）已知基因的獲得①化學(xué)合成法②PCR擴(kuò)增（2）未知基因的獲得①構(gòu)建基因組文庫(kù)，篩選目的基因②構(gòu)建cDNA文庫(kù)，篩選目的基因③mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因④差異蛋白質(zhì)譜表達(dá)技術(shù)篩選功能基因……第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①銀杏葉RNA提取②反轉(zhuǎn)錄cDNA③chs全長(zhǎng)cDNA的克隆④TA克隆及測(cè)序⑤向chs兩端引入酶切位點(diǎn)⑥雙酶切⑦定向克隆⑧導(dǎo)入農(nóng)桿菌

2.植物表達(dá)載體的構(gòu)建第5頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五例pBI121-chs構(gòu)建pBI121圖譜第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五銀杏chs基因植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖chs

β-glucuronidose

NOSter

CaMV35Pchs第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五3.受體材料的準(zhǔn)備細(xì)胞的全能性：分化細(xì)胞脫分化再分化第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五4.遺傳轉(zhuǎn)化（1）間接轉(zhuǎn)化法——農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

（2）直接轉(zhuǎn)化法

A、基因槍轉(zhuǎn)化法

B、電擊法

C、花粉管通道法

D、PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五根癌農(nóng)桿菌

(Agrobacteriumtumefaciens),是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,它含有Ti質(zhì)粒,能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成腫瘤,即誘發(fā)冠癭瘤.Ti質(zhì)粒(包括Ri質(zhì)粒)上有一段轉(zhuǎn)移DNA,在農(nóng)桿菌侵染宿主植物時(shí),這段DNA可以轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞,并穩(wěn)定地保留在植物細(xì)胞染色體中,變?yōu)橹参锛?xì)胞新增加的一群基因,最終能通過有性世代遺傳給子代。返回第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五基因槍轉(zhuǎn)化法由美國(guó)Cornell大學(xué)的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢粒或金粒)表面,通過高壓驅(qū)動(dòng)力加速微粒穿透植物細(xì)胞壁,導(dǎo)入受體組織細(xì)胞內(nèi),然后通過組織培養(yǎng)再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后,整合到染色體上并得到表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化.。返回第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五電擊法的主要原理是將原生質(zhì)體在溶液中與DNA混合,然后利用高壓電脈沖作用,使原生質(zhì)體膜的某些部位被擊穿而產(chǎn)生可回復(fù)的小孔,外源DNA可通過小孔進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi),而且不影響經(jīng)電擊處理的原生質(zhì)體再生植物的能力.返回第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五花粉管通道法是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道,直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜?xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化.返回第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子.PEG可促使細(xì)胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細(xì)胞間的識(shí)別,利于細(xì)胞膜間的融合以及外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體.返回第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五表1幾種植物轉(zhuǎn)基因方法比較

轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)化的缺點(diǎn)DNA間接轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移受體種類，可以在原生質(zhì)體、蛋細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)、組織器官或整株等多級(jí)水平上進(jìn)行，方法成熟可靠，簡(jiǎn)便易行，周期短，轉(zhuǎn)化率高；轉(zhuǎn)化雙子葉植物為主。大多數(shù)單子葉植物和裸子植物對(duì)農(nóng)桿菌的侵入不敏感，限制了該法在禾谷類作物中的應(yīng)用。轉(zhuǎn)化體常出現(xiàn)“嵌合”現(xiàn)象，需在嚴(yán)格條件下加以選擇以淘汰未轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA直接轉(zhuǎn)化法（1）基因槍轉(zhuǎn)化法（2）電擊法（3）PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法（4）花粉管通道法無宿主限制，適用于各種單、雙子葉植物，操作簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)化效率低，需要專門設(shè)備（電擊儀、顯微操作儀或基因槍），多數(shù)需要原生質(zhì)體與愈傷組織，周期太長(zhǎng)（電擊法）第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五5.轉(zhuǎn)化組織——農(nóng)桿菌介導(dǎo)之葉盤轉(zhuǎn)化法帶有轉(zhuǎn)化基因的農(nóng)桿菌活化受體植物葉盤侵染共培養(yǎng)篩選培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗預(yù)培養(yǎng)葉盤，或愈傷組織第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五遺傳轉(zhuǎn)化主要的影響因素：1.預(yù)培養(yǎng)時(shí)間：一般0~3天，過長(zhǎng)不利于侵染2.農(nóng)桿菌濃度：用MS（pH=7.0）鹽溶液調(diào)OD值（一般在0.2~1.0）3.侵染時(shí)間：時(shí)間應(yīng)適中，太短轉(zhuǎn)化率低；太高則后期農(nóng)桿菌難以除凈，毒害材料。4.共培養(yǎng)時(shí)間5.乙酰丁香酮（AS）處理：處理方式及濃度

(A)僅共培養(yǎng)基中加AS(B)僅菌液中加AS(C)菌液和共培養(yǎng)基中均加ASAS使用濃度：50μM~200μM實(shí)驗(yàn)結(jié)論：A與C效果最好且差異不明顯第19頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五6.煉苗第20頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五7.轉(zhuǎn)基因苗的篩選與鑒定培養(yǎng)過程中利用標(biāo)記基因篩選標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因(Slectivegene)報(bào)告基因(Reportgene)抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物安全性標(biāo)記類選擇基因……β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)熒光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Cat)綠色熒光蛋白基因(Gfp)……第21頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五例Gus檢測(cè)原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催化β－葡萄糖苷酯類物質(zhì)水解。其中很多水解產(chǎn)物具有發(fā)色團(tuán)或形成熒光物質(zhì)。例：組織化學(xué)法測(cè)定Gus活性作用底物為X-gluc,產(chǎn)物是一種不可溶的5,5-二溴，4,4-二氯靛藍(lán)；第22頁，共24頁，2023年，2月20日，星期五轉(zhuǎn)基因植物的PCR檢測(cè)外源基因整合的PCR-Southern雜交檢測(cè)外源基因拷貝的I