不同濃度氯化鈷誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元細胞缺氧損傷模型的比較肖婷婷1，王莉1，曹相玫2，倪新莉1*(寧夏醫(yī)科大學(xué):1.臨床醫(yī)學(xué)院，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川750004)基金項目:國家自然科學(xué)基金地區(qū)項目（81660229）;寧夏科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項目（KJT2015017）*通訊作者:倪新莉電話E-mail:1284813176@;【摘要】目的:研究不同濃度的氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元細胞（HT22）缺氧損傷模型的比較。方法:用不同濃度(0、50、100、200μmol/L)CoCl2建立HT22細胞缺氧模型。通過HE染色觀察HT22細胞軸突生長的特征，CCK8法檢測HT22細胞體外增殖活性的變化，同時，WesternBlot檢測HT22細胞中HIF-1α、tau5的表達情況。結(jié)果:HE顯示CoCl2可致HT22細胞軸突斷裂，CCK8顯示CoCl2對HT22細胞增殖抑制作用表現(xiàn)出濃度依賴性。WesternBlot顯示CoCl2濃度為200μmol/L時,HIF-1α、Tau5蛋白表達與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：CoCl2可劑量依賴性上調(diào)HT22細胞HIF-1α表達，致軸突損傷及tau5降低，建立細胞缺氧模型簡單易行。【關(guān)鍵詞】HT22細胞;氯化鈷;軸突；HIF-1αComparisonofhypoxicinjurymodelsofhippocampalneuronsinducedbydifferentconcentrationsofcobaltchlorideinmiceXiaoTingting1,WangLi1,CaoXiangmei2,NiXinli1*(1.School

of

Clinical

Medicine,2.SchoolofBasicMedicine,，NingxiaMedicalUniversityYinchuan750004,China)[Abstract]:Objective:Tocomparethehypoxiainjurymodelofmousehippocampalneuroncells(HT22)inducedbydifferentconcentrationsofcobaltchloride(CoCl2).Methods:ThehypoxiamodelofHT22cellswasestablishedwithdifferentconcentrations(0,50,100,200μmol/L)ofCoCl2.ThecharacteristicsofaxongrowthofHT22cellswereobservedbyHEstaining.TheCCK8methodwasusedtodetectthechangesofHT22cellproliferationactivityinvitro.Atthesametime,WesternBlotwasusedtodetecttheexpressionofHIF-1αandtau5inHT22cells.Results:HEshowedthatCoCl2couldcauseaxonruptureinHT22cells,andCCK8showedthatCoCl2hadaconcentration-dependentinhibitioneffectonHT22cellproliferation.WesternBlotshowedthatwhentheconcentrationofCoCl2was200μmol/L,theexpressionsofHIF-1αandTau5proteinweresignificantlydifferentfromthoseofthecontrolgroup.Conclusion:CoCl2canup-regulateHIF-1αexpressioninHT22cellsinadose-dependentmanner,causeaxonaldamageanddecreasetau5,anditiseasytoestablishamodelofcellhypoxia.

[Keywords]HT22cells;Cobaltchloride;axons;HIF-1α缺氧缺血性（hypoxiaischemia，HI）腦損傷是窒息、心臟驟停以及心肺復(fù)蘇后最常見的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，也是致殘致死的嚴重疾病之一。有研究表明HI腦損傷后期的腦癱、癲癇、行為和學(xué)習(xí)障礙可能與神經(jīng)元軸突功能異常有關(guān)[1,2]，但缺氧缺血對神經(jīng)元軸突生長的具體作用還有待證實。常用細胞缺血缺氧模型制備需要包括三氣培養(yǎng)箱、氣源等設(shè)備[3]。在實驗室基礎(chǔ)設(shè)施有限的條件下，本研究利用CoCl2構(gòu)建HT22細胞缺氧模型，通過形態(tài)學(xué)觀察缺氧對神經(jīng)元細胞增殖及軸突生長的影響，以及缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和軸突標志蛋白tau5的表達，為研究軸突對HI腦損傷遠期功能的影響奠定實驗基礎(chǔ)。1材料與方法細胞與主要試劑小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22,由寧夏醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)黑長春教授惠贈。DMEM/F12培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胎牛血清FBS購自BI公司；氯化鈷購自上海廣諾化學(xué)科技有限公司；抗HIF-1α抗體、抗β-actin抗體均購自北京博奧森公司；抗tau5抗體購自abcam公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗購自Abbkine公司；CCK-8試劑盒購自上海尚寶公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒和SDS凝膠配制試劑盒均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。實驗方法1.2.1細胞培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞復(fù)蘇后,培養(yǎng)1～2代進行缺血缺氧細胞的模型建立。1.2.2缺血缺氧細胞模型的制備將適量的化學(xué)缺氧劑CoCl2溶于DMEM/F12培養(yǎng)基中,配制成1000mmol/L的母液,分裝入EP管,-20℃冰箱保存。待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，用不同終末濃度（0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）的氯化鈷培養(yǎng)基干預(yù)細胞24小時，用于模擬細胞缺氧微環(huán)境。1.2.3CCK8法檢測將對數(shù)生長期HT22細胞以1×104個接種于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔，24小時細胞貼壁后，向每孔加入氯化鈷終濃度為：0umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后換液，加入正常培養(yǎng)液每孔100μl及CCK8溶液每孔10μl，孵育2小時后，用酶標儀測定在450nm處的吸光度。1.2.4HE染色調(diào)整細胞密度至4×104個/ml，以500μl/孔接種于24孔板進行細胞爬片，過夜貼壁后用氯化鈷進行缺氧干預(yù)。24h后用4%多聚甲醛固定，蘇木素-伊紅（HE）染色，脫水后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察神經(jīng)元軸突損傷情況、拍照。1.2.5WesternBlot收集不同濃度(0、50、100、200μmol/L)CoCl2誘導(dǎo)24h的HT22細胞,提取全蛋白100℃煮沸5min,冷卻后(10000r/min1min)離心,蛋白變性后保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｓ肂CA試劑盒定量蛋白，使用等量蛋白(50μg/10μl)上樣進行聚丙烯氨凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)電泳轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2h，用WB一抗稀釋液稀釋一抗(HIF-1α1∶500、tau51:1000、β-actin1∶1000)4℃孵育過夜。二抗(山羊抗兔IgG，山羊抗鼠IgG1∶2000)室溫孵育1h，化學(xué)發(fā)光試劑顯色1min，曝光并進行灰度測量。1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各獨立實驗均重復(fù)3次，計量資料以x±s表示，CoCl2干預(yù)組和空白對照組的比較，采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1CoCl2對HT22細胞增殖能力影響HT22細胞在含有不同濃度（50、100、200μmol/L）CoCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，細胞增殖能力與陰性對照組比較，細胞活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig．1A）。提示：氯化鈷明顯抑制小鼠HT22細胞的生長，且呈劑量依賴性。形態(tài)觀察結(jié)果顯示，對照組HT22細胞貼壁，分散均勻。細胞伸出單個或多個突起，呈錐形立體感較強。CoCl2損傷后，細胞突起變短或丟失、胞體變圓，細胞立體感下降。且隨著氯化鈷濃度的升高，細胞損傷程度逐漸加重（Fig．1B）。Fig.1:EffectofCoCl2ontheproliferationabilityofHT22cells:**representsP<0.01,***representsP<0.001,andA:CCK8detectscellviability.B:Morphologicalobservation(20Xinvertedmicroscope).2.2CoCl2對HIF-1α蛋白表達的影響細胞經(jīng)CoCl2處理后，Westernblot-ting檢測HIF-1α蛋白表達。實驗結(jié)果顯示，正常情況下，HIF-1α蛋白在HT22細胞中的表達非常低。隨著氯化鈷濃度的增加，HIF-1α蛋白表達逐漸增多，當(dāng)氯化鈷濃度為100μmol/L時,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05。當(dāng)氯化鈷濃度為200μmol/L時，HIF-1α蛋白表達與對照組相比差異更加顯著P<0.01（Fig．2）。Fig.2:TheexpressionofHIF-1αproteinlevelofHT22cellswasdetectedbyWesternBlotineachgroup．A:showsHIF-1αandβ-actindetectedin92kDand42kD，respectively;B:showstherelativeproteinexpressionofHIF-1αinHT22cells．*RepresentsP<0.05,**representsP<0.01.2.3CoCl2對HT22細胞軸突生長的影響HT22細胞經(jīng)不同濃度（0、50、100、200μmol/L）CoCl2處理后，HE染色觀察可見，隨著干預(yù)濃度的增加，神經(jīng)元軸突逐漸縮短、斷裂（Fig．3A,B）。W-b測定軸突標志物蛋白Tau5的表達，結(jié)果顯示，隨著損傷程度的增加，Tau5蛋白的表達量呈劑量依賴性降低，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05。且氯化鈷濃度為200μmol/L時，Tau5蛋白的表達量最低（Fig．3C,D）。Fig.3:EffectofCoCl2onaxongrowthofHT22cells:HEstainingobservation:A(10Xuprightmicroscope),B(20Xuprightmicroscope);C:TheexpressionofTau5proteinlevelofHT22cellswasdetectedbyWesternBlotineachgroup．D:showstherelativeproteinexpressionofTau5inHT22cells,*RepresentsP<0.05,**representsP<0.01.3討論鈷是缺氧樣反應(yīng)中著名的化學(xué)誘導(dǎo)劑之一[4,5]，是一種具有廣泛工業(yè)和生物應(yīng)用的鐵磁金屬。一些報道顯示，在不同來源的細胞中，氯化鈷（CoCl2）可以決定HIF-1α調(diào)節(jié)亞基的穩(wěn)定性，從而激活促紅細胞生成素，VEGF和其他基因[6,7]。鈷通過取代卟啉環(huán)中的鐵來激活細胞氧傳感器[8]，從而導(dǎo)致細胞和組織缺氧，并上調(diào)細胞內(nèi)HIF-1α的表達。有研究表明CoCl2可能通過以下兩種方式來增加HIF-1α的蛋白表達：一是通過蛋白酶體抑制HIF-1α的降解，增加其穩(wěn)定性；二是通過ROS形成直接增強HIF-1α的穩(wěn)定[9-11]。神經(jīng)元是一種高度分化的細胞，是神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。軸突作為神經(jīng)元的組成結(jié)構(gòu)，具有輸出胞體整合的神經(jīng)電信號的功能。既往研究顯示，缺氧缺血后神經(jīng)元軸膜通透性改變、軸突外側(cè)Ga2+內(nèi)流、蛋白酶激活、線粒體結(jié)構(gòu)破壞、功能受損、軸突斷裂，無法延伸；同時，缺氧選擇性的改變了髓鞘磷脂蛋白在發(fā)育中腦白質(zhì)髓鞘形成進程中的表達，影響了神經(jīng)纖維細絲正常的磷酸化，限制了軸突徑向生長的能力，導(dǎo)致軸突直徑變細、髓鞘厚度變薄，軸突數(shù)量減低，突觸形成困難[12,13]。本研究利用CoCl2的作用特性，誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元細胞缺氧。CCK8實驗顯示，HT22細胞活性顯著降低，Westernblot實驗顯示，細胞經(jīng)CoCl2處理后，HIF-1α蛋白的表達顯著上調(diào)。這在一定程度上證實了本實驗采用氯化鈷誘導(dǎo)化學(xué)缺氧模型的可靠性，與國內(nèi)外的研究結(jié)果一致[14,15]。神經(jīng)元軸突功能異常是缺血缺氧腦損傷后神經(jīng)功能障礙的重要病理基礎(chǔ)，本研究形態(tài)觀察結(jié)果顯示，隨著氯化鈷濃度的增加，軸突斷裂程度增加。W-b測定軸突標志物蛋白Tau5的表達，結(jié)果顯示，隨著損傷程度的增加，Tau5蛋白的表達量逐漸降低，該結(jié)果也和之前文獻報道的結(jié)果相符[16]。綜上所述，本研究利用氯化鈷誘導(dǎo)HT22細胞化學(xué)缺氧，操作簡便，結(jié)果穩(wěn)定、可靠。并且證明缺氧會使神經(jīng)元軸突縮短，為改善缺血缺氧后腦功能障礙提供新思路。參考文獻[1]FerrieroDM.Neonatalbraininjury.NEnglJMed2004;351:1985-95[2]DrobyshevskyA,JiangR,LinL,DerrickM,LuoK,BackSA,TanS.Unmyelinatedaxonlosswithpostnatalhypertoniaafterfetalhypoxia.AnnNeurol2014;75:533-41[3]葉乃菁,吳新萍,李明權(quán),王志勇.細胞缺氧復(fù)氧模型制備方法及應(yīng)用[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2018,30(08):1563-1566.[4]Mu?oz-SánchezJorge,Chánez-CárdenasMaríaE.Theuseofcobaltchlorideasachemicalhypoxiamodel.[J].Journalofappliedtoxicology:JAT,2018.[5]XiaoLLanA,MoL,etal.HydrogensulfideprotectsPC12cellsagainstreactiveoxygenspecie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