放射免疫分析第1頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五目的與要求：掌握放射免疫分析的基本原理，實驗室配置及質(zhì)量控制。內(nèi)容：放射免疫分析(RIA)是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)建的一種體外放射分析技術(shù)。這是檢驗專業(yè)學(xué)生必須掌握和重點。2第2頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)基本原理一、必須掌握放免分析的基本原理：放射免疫分析是在體外條件下，由非標(biāo)記抗原與定量的標(biāo)記抗原對限量的特異性抗體的競爭性抑制的反應(yīng)。3第3頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五參加反應(yīng)的有標(biāo)記抗原、非標(biāo)記抗原(標(biāo)記抗原或待測抗原)和特異性抗體，如下幾點必須透徹理解：

1、標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原和特異抗體結(jié)合的能力被認為是相同的。

2、標(biāo)記抗原與特異性抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，非標(biāo)記抗原與特異性抗體結(jié)合形成非標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。4第4頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五

3、標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原之和多于物質(zhì)異性抗體結(jié)合位點。這樣當(dāng)反應(yīng)達到平稀時，標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的生成量受非標(biāo)記抗原數(shù)量的制約。例如：非標(biāo)記抗原數(shù)量增加時，就會抑制標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合，標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的生成量就減少，未與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原的數(shù)量加。這種特異性的競爭性抑制的數(shù)量關(guān)系就是放射免疫分析的定量基礎(chǔ)。標(biāo)記抗原與被測物質(zhì)間的數(shù)量關(guān)系可以用抑制曲線來表示。這種曲線表示了結(jié)合抑制的程度與抑制物濃度兩者之間的特定函數(shù)關(guān)系，也稱為劑量反應(yīng)曲線。5第5頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五二、劑量反應(yīng)曲線劑量反應(yīng)曲線又稱標(biāo)準(zhǔn)曲線。是放射免疫分析定量的基礎(chǔ)，是衡量物質(zhì)濃度的客觀尺度(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的手工繪制形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線的形態(tài)可因所用的反應(yīng)變量表達形式的不同，或所采用坐標(biāo)系統(tǒng)不同而有不同的形態(tài)。(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線的基本數(shù)學(xué)函數(shù)式放射免疫分析從抗原抗體反應(yīng)動力學(xué)分析，反應(yīng)是雙向性的，服從質(zhì)量作用定律。6第6頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五

(三)掌握親和常數(shù)K值的計算、意義及應(yīng)用、平衡常數(shù)K又稱親和常數(shù)，或叫做結(jié)合常數(shù)。該常數(shù)對特定的抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)是固定不變的。K的單位為1mol或L/mol。其意義在于可用K值反映抗體之間的親和力。K值與游離抗體濃度呈反比關(guān)系。K值越大，則游離的抗體濃度［Ab］越小，結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物［Ag-Ab］濃度越大。即抗原抗體的結(jié)合力越大。K值是與抗原抗體共同相關(guān)的數(shù)值，不能認為僅僅是抗體(或抗原)之間的K值。目前，國內(nèi)外有多種計算K值的方法，有的非常復(fù)雜，而通常使用的方法是Scatchard分析作圖法。7第7頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五(四)掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對測定的影響標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率對放射免疫分析方法的靈敏度和精密度均有影響。影響標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的因素：

1、親和常數(shù)K2、標(biāo)記抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原的用量

3、特異性抗體的用量(五)掌握Bo(總結(jié)合)、T(總管)、NSB的概念8第8頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)放射免疫分析方法學(xué)一、掌握建立放射免疫分析方法的必備條件(一)對標(biāo)準(zhǔn)抗原的基本要求

(1)標(biāo)準(zhǔn)抗朱與待測抗原的免疫性必須一致，即它們與抗體的親和力和特異性應(yīng)相同。標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測抗原所處的介質(zhì)條件應(yīng)基本相同。

(2)抗原必須純度度。

(3)標(biāo)準(zhǔn)抗原的量必須準(zhǔn)確。

(4)標(biāo)準(zhǔn)抗原應(yīng)有很好的穩(wěn)定性。9第9頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五(二)對抗血清的要求抗血清中含有對其相應(yīng)抗原的特異性抗體。目前常以抗原免疫年輕、健康的純種小動物而誘發(fā)產(chǎn)生多克隆抗體，選取抗體滴度高的血清，為RIA所用。抗血清的質(zhì)量直接影響放射免疫分析方法的靈活敏度和特異性。檢查抗血清質(zhì)量的指標(biāo)主要有親和常數(shù)(K)、免疫交叉反應(yīng)率及滴度(或抗體效價)。10第10頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五(三)對標(biāo)記抗原的要求標(biāo)記抗原是放射性測定的依據(jù)，對標(biāo)記抗原的基本要求：1、標(biāo)記抗原的免疫活性與待測抗原及標(biāo)準(zhǔn)品必須一致。2、標(biāo)記抗原要有適當(dāng)高的放射性比活度。3、標(biāo)記抗原應(yīng)具有足夠高的放射化學(xué)純度11第11頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五(四)分離B與F的方法理想分離應(yīng)滿足如下要求：1、分離B、F完全、快速。2、不影響免疫反應(yīng)的平衡條件。3、不受分離操作時的環(huán)境因素(如pH、溫度等)的影響。4、操作簡便，分離試劑的來源豐富且價廉。12第12頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五目前的分離方法有：1、非特異性分離法(1)吸附法：利用表面活性物質(zhì)將反應(yīng)的液中小分子游離部分F吸附，通過離心，將F沉淀，使大分子結(jié)合物B留在上清液中，而達到分離的目的。(2)過濾法：反應(yīng)液中B與F混合物在通過一定規(guī)格孔徑的濾膜時，大分子不會通過濾膜孔被阻留在濾膜上，小分子游離的放射性物質(zhì)F被抽吸通過濾膜而分離。(3)沉淀法。13第13頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五2、特異性分離法

(1)雙抗法(Ab2法)：應(yīng)用抗IgG的第二抗體來分離B和F的方法稱為雙抗體法。雙抗體法具有特異、高效、非特異性結(jié)合低、重復(fù)性好等優(yōu)點。在使用此法時，往往加入適量的第一抗體同種動物血清作載體。同時第二抗體必須是過量(但也不宜過大)，且以不影響反應(yīng)平衡為宜.(2)固相分離法：將特性抗體(第一或第二抗體)或抗原結(jié)合在固相物質(zhì)。

(3)金黃色葡萄球菌A蛋白分離法。14第14頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五二、掌握放射免疫分析的設(shè)計方法：(一)標(biāo)譏抗原和抗體用量最佳化設(shè)計。1、標(biāo)記抗原用量選擇。2、抗血清的使用滴度選擇及其方法。(二)標(biāo)準(zhǔn)抗原劑量設(shè)計1、標(biāo)準(zhǔn)抗原劑量范圍2、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍(三)加樣順序設(shè)計(四)反應(yīng)介質(zhì)15第15頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五(五)反應(yīng)容積與溫度及時間

1、反應(yīng)容積縮小反應(yīng)容積可相應(yīng)減少抗體和標(biāo)記抗原的絕對用量，使非標(biāo)記抗原的競爭力相應(yīng)增強，有利于提高靈敏度，使反應(yīng)試劑消耗減少。

2、溫育溫度和時間抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)的平衡結(jié)合常數(shù)K與溫度有關(guān)必須通過實驗來確定最佳工作條件。(六)B與F分離方法選擇(七)樣品采集與保存16第16頁，共18頁，2023年，2月20日，星期五第四節(jié)放射免疫分析的質(zhì)量控制一、掌握誤差和放射免疫誤差的來源

(一)誤差及其分類

(二)放射免疫分析誤差來源二、掌握質(zhì)量控制與質(zhì)控樣品

(一)放射免疫分析的質(zhì)量控制內(nèi)容

(二)