植物病原真菌的分離培養及純化技術詳解演示文稿現在是1頁\一共有59頁\編輯于星期二（優選）植物病原真菌的分離培養及純化技術現在是2頁\一共有59頁\編輯于星期二3現在是3頁\一共有59頁\編輯于星期二42）制作步驟馬鈴薯洗凈，去皮稱200g切塊/條，1000ml水煮沸30min，用雙層紗布濾去薯塊，加入15-20g瓊脂，加熱熔化，再加20g葡萄糖，待完全溶解后，趁熱用雙層紗布再過濾，補水并定容到1000ml,分裝于三角瓶或試管中，塞好棉塞并包上牛皮紙，扎緊后高壓滅菌。現在是4頁\一共有59頁\編輯于星期二5自然pH；調pH值，也可用1mol/L的NaOH或HCl調至pH為5.5～6.5之間，最后加水補足至1000mL。Tips:

實驗中使用的水，一般情況下并不要求用蒸餾水，只要水比較潔凈，沒有有害物質就可以了，硬水（井水）含有較多的鈣鎂離子，配制的培養基沉淀較多，最好避免使用。現在是5頁\一共有59頁\編輯于星期二62、植物組織和煎汁

許多植物材料如豆莢、莖稈、種子等，可以放在試管中，加少量水份以保持濕潤，滅菌后即能做培養基使用。

植物煎汁是很好的培養基，可以滿足普通微生物的營養需要，各種植物的煎汁都可用作培養液，如加瓊脂即能制成固體培養基。當然，必須滅菌后才能使用。現在是6頁\一共有59頁\編輯于星期二73、培養基的分裝根據不同需要，可將制好的培養基分裝入試管或三角瓶中。試管分裝時，使用玻璃漏斗。裝入量視試管大小及用途而定，固體培養基的分裝量為管高的1/5左右，用三角瓶分裝培養基時，容量不宜超過容積的1/3----1/2。注意：不要將培養基沾到管口或瓶口上，以免沾濕棉塞而引起污染。現在是7頁\一共有59頁\編輯于星期二8制備好的培養基必須經過滅菌，方能使用。4、滅菌高壓蒸汽滅菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持續15-30min，培養基及其它一些用品可用此法滅菌。分離培養時需要的培養皿等，要事先洗凈、晾干/烘干、包裝好，進行干熱滅菌。滅菌方法：高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌、過濾滅菌化學滅菌、以及輻射滅菌等。現在是8頁\一共有59頁\編輯于星期二9

濾膜孔徑主要有0.22μm和0.45μm兩種。過濾太快，濾液中將混入細菌而使除菌不完全。現在是9頁\一共有59頁\編輯于星期二10現在是10頁\一共有59頁\編輯于星期二115、斜面、平板培養基的制作試管培養基滅菌后，要趁熱斜放。先在桌上放一長木板條，然后逐個擺放，使培養基斜面長度為試管長度的2/5至3/5，冷凝后即成斜面培養基。三角瓶中的培養基可趁熱倒入已滅菌的培養皿中，制作平板培養基。方法是：將培養基冷卻至45～50℃（低于45℃易凝固，應在水浴鍋中加熱融化），左手拿培養皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌將三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼燒瓶口片刻，在酒精火焰旁將培養皿打開一小縫，使瓶口正好伸入，傾入培養基約15mL，平置、凝固即成。注意：操作者事先必須洗凈手，并用70%酒精消毒。現在是11頁\一共有59頁\編輯于星期二12二、真菌分離

植物病原菌的分離培養，是植物病理實驗室工作中的基本技能。現在是12頁\一共有59頁\編輯于星期二13真菌的分離---就是將所需要的真菌與其它雜菌分開，供給適當的條件，使它們繁殖而得到純培養。

一般是根據該微生物對營養、酸堿度、氧氣等條件要求不同，而供給它們適宜的生活條件，即讓病原菌生活在適宜的培養基上，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環境，從而得到純菌株。現在是13頁\一共有59頁\編輯于星期二14

觀察一種真菌病害的標本，不一定都能檢查到子實體而作出診斷。同時，在病部表面或組織中檢查到的真菌，有時也不能斷定就是它的病原物，也有可能是植物組織死亡后在上面生長的腐生性真菌。因此，對有些病害病原物的確定，最好是經過分離和培養工作，且在適當的環境下進行接種試驗，確定它的致病性。此外，為了進一步研究真菌的形態、生活史、生理和生態，或者用于發酵如生產抗菌素等，分離而獲得真菌的純培養物是必要的。（一）目的意義現在是14頁\一共有59頁\編輯于星期二15分離和培養應該在無菌至少很清潔的條件下進行。（二）、真菌分離的程序1．分離前的準備工作現在是15頁\一共有59頁\編輯于星期二161.1清潔環境：分離工作嚴格說應在無菌條件下進行，無菌室或無菌箱是分離不可缺少的設施。為了保證無菌操作，應注意下面幾點：1.2若限于條件實驗只能在普通房間進行時，必須對房間進行徹底掃除，清潔環境、搞好衛生。地上多灑些水，以消除室內塵埃，工作臺上鋪好濕毛巾，點燃酒精燈。現在是16頁\一共有59頁\編輯于星期二171.3分離工作開始前最好將所需的一切用品都準備好，放在超凈工作臺內或伸手可及的臺外，以避免操作過程中頻繁走動，破壞環境帶來雜菌；1.4保證工作人員自身的潔凈，工作前用肥皂洗手；1.5無菌操作前還要用70％酒精擦手；1.6工作中，特別在進行無菌操作時，呼吸要輕，不要說話等。現在是17頁\一共有59頁\編輯于星期二18分離材料的選擇對分離培養的成敗有著決定的影響。

病害材料應盡可能新鮮，如可選擇新近發病的植株、器官或組織作為分離的材料，可以減少腐生菌的污染。

最好在病、健交接處選材取樣。病、健交接處，除材料新鮮，污染的可能性小外，病原菌的生活力強、比較活躍，容易分離成功。2．分離材料的選擇現在是18頁\一共有59頁\編輯于星期二19

例如：果實的腐爛病，就應該從剛開始腐爛的部分分離。根腐病和枯萎病也是如此，應該盡可能從病株離土需較遠的部分分離。值得注意的是有些有暈圈的斑點病（如野火病），病菌局限在斑點中央的壞死組織中，從病斑的邊緣是分離不到病菌的。當然，這類病害是比較少的。從受害的邊緣部分分離這一原則，對于絕大部分病害都是適用的。現在是19頁\一共有59頁\編輯于星期二20

采得的材料如已經敗壞而沾染大量的腐生菌，有時可以采用接種后再分離的方法，即將沾染有腐生菌的病組織作為接種材料，直接接種在健全的植物組織工植株上，等發病后再從病株或病組織分離。先接種再分離的方法，用得較多的是植物病原細菌的分離。

引起果實和蔬菜腐爛病的真菌，如腐霉屬(Pythium)和疫霉屬(Phytophthora)的真菌，用這種方法分離的效果也很好。分離煙草的根腐病菌(Thielaviopsis)，用這種方法效果也很好，將煙草種子播在培養皿中的吸水紙上，然后用田間采得的煙草病根切成小塊，撒在種間，幼苗染病后移到胡蘿卜瓊脂培養基平板上，病菌即生長而得到純培養。現在是20頁\一共有59頁\編輯于星期二21

（1）酒精

用酒精（70%）消毒，只浸很短的時間（幾秒鐘到1分鐘），然后用滅菌水沖洗；較大的材料往往是在酒精中浸過后，或用棉花塞蘸酒精涂在組織表面，然后都在火焰上將酒精燒去。3．組織的表面消毒劑現在是21頁\一共有59頁\編輯于星期二22配方為：升汞1g，

濃鹽酸

2.5mL，

加水 至

1000mL。將升汞溶于濃鹽酸中，待其充分溶解后，用水稀釋。升汞劇毒、無色，為便于認識，可在溶液中加幾滴紅染料。消毒時間因材料質地、發病部位深淺及污染情況而異，一般3～5分鐘。消毒后用無菌水沖洗3～4次。（2）升汞溶液（0.1%）現在是22頁\一共有59頁\編輯于星期二23（3）次氯酸鈉NaClO3

由于漂白粉的成分不固定而影響其消毒效果，目前多改用次氯酸鈉.

消毒所用的濃度一般是3%-5%的水溶液，消毒時間5-15分鐘。

幼嫩的病組織，表面用藥劑消毒時可能會同時殺死其中的病原真菌，消毒時間應盡量縮短。比較安全的方法是不用藥劑消毒，而以滅菌水洗8、9次。現在是23頁\一共有59頁\編輯于星期二244．常規分離方法植物病原真菌的分離方法主要有兩種：

組織分離法和稀釋分離法。組織分離法是最常用的方法.稀釋分離法主要用于病組織上產生大量孢子的病原真菌的分離。現在是24頁\一共有59頁\編輯于星期二25植物病原真菌的分離一般都是用組織分離法。就是切取小塊病健組織，經表面消毒和滅菌水洗過以后，移殖在瓊脂培養基平板上培養。切取組織的大小要適宜，一般可將較大的組織，在消毒液中消毒后切取中央部分，經滅菌水洗過以后培養。4.1組織分離法現在是25頁\一共有59頁\編輯于星期二261）選取典型的病組織，在病健交界處將其剪成5mm×5mm的小方塊若干，裝于火焰滅菌的小碟中。注:選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機會。腐生菌一般在發病很久而已經枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點病害應在臨近健全組織的部分分離。

植物病原真菌的組織分離的技術與步驟：現在是26頁\一共有59頁\編輯于星期二272）向裝有病組織的小碟中加入70%酒精（約半碟）進行表面消毒，十幾秒后倒掉酒精。

注:先用70％的酒精浸2、3s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時間較短(一般數秒至lmin)。現在是27頁\一共有59頁\編輯于星期二283）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸鈉溶液（約半碟）進行表面消毒，處理時間可自30秒至3分鐘不等，然后倒掉廢液。注：升汞溶液消毒的時間因材料而異，可自30s至30min不等，如植物組織柔嫩，則表面消毒時間宜短；反之則可長些一般情況下，需時間3、5min。

現在是28頁\一共有59頁\編輯于星期二294）向小碟中加滅菌水，沖洗3-4次（除去殘留的消毒劑），將病組織轉移到滅菌濾紙上吸去多余的水（以大大減少病組織附近出現細菌污染）。現在是29頁\一共有59頁\編輯于星期二305）將吸干水分的病組織移到預先倒好的PDA平板上，注意要用鑷子輕壓組織使其著靠在培養基上。現在是30頁\一共有59頁\編輯于星期二316）每皿5塊，均勻擺放，倒置于25℃培養箱中培養。4-5天后檢查結果。寫明日期、姓名等。現在是31頁\一共有59頁\編輯于星期二32各種真菌病害發生的部位和癥狀不同，其分離要根據具體情況，采用不同的方法，下面介紹幾種典型材料的分離法。4.1.1斑點病病原真菌的分離4.1.2維管束組織內病原真菌的分離4.1.3根腐病菌的分離4.1.4肉質組織中病菌的分離4.1.5種子內病菌的分離法現在是32頁\一共有59頁\編輯于星期二334.1.1斑點病病原真菌的分離

從病斑切取每邊約3-5mm的小塊病組織，用70%的酒精浸幾秒鐘，再在0.1%的酸性升汞水溶液中浸3-5分鐘；而后用滅菌水換洗3次，將其移置在瓊脂培養基平板上培養。現在是33頁\一共有59頁\編輯于星期二344.1.2維管束組織內病原真菌的分離現在是34頁\一共有59頁\編輯于星期二35

從根莖維管束組織分離病菌，可先將寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，將表皮組織用滅菌的解剖刀削去，然后切取其中小塊變色的維管束組織，用升汞或漂白粉液消毒后，用滅菌水沖洗幾次，移置培養基面上。現在是35頁\一共有59頁\編輯于星期二364.1.3根腐病菌的分離

根腐或基腐病菌的分離，由材料的大小決定。材料小的可以仿照斑點病的分離法。材料大的則可采用維管束組織內病原真菌的分離法。現在是36頁\一共有59頁\編輯于星期二374.1.4肉質組織中病菌的分離

多肉的莖、根和果實等，可以采用維管束組織內病菌的分離法，除去表面組織，切到其中小塊病組織分離。如有雜菌感染可采用“直接接種”法，待出現癥狀后，用此法再行分離。現在是37頁\一共有59頁\編輯于星期二38現在是38頁\一共有59頁\編輯于星期二39種子如在未破裂的果莢內，可以不經過表面消毒，在無菌的條件下取出移在培養基平板上培養。4.1.5種子內病菌的分離法

將整粒的種子或種子的一部分進行表面消毒（升汞或漂白粉），用滅菌水洗滌后移在瓊脂培養基平板上培養。現在是39頁\一共有59頁\編輯于星期二40

稀釋法是微生物學上最早使用的分離法，主要用于分離細菌和酵母菌等。4.2稀釋分離法植物病原真菌的分離一般很少用稀釋法分離，但有些產生大量孢子的病原真菌和霉菌，可以配成孢子懸浮液稀釋分離。現在是40頁\一共有59頁\編輯于星期二41方法：用無菌水從發病組織表面沖下孢子，配成孢子懸浮液，用無菌移液管或滴管吸取一定體積的菌液至平板培養基上，然后用無菌玻璃棒將菌液輕輕的均勻涂布在整個平板上，或將菌液移至無菌培養皿中，然后傾入融化后冷卻至45℃的培養基，輕輕振蕩、平置、凝固后倒置培養。現在是41頁\一共有59頁\編輯于星期二424.2.1孢子分離法

產生大量孢子的病菌如青霉屬(Penicillium)、交鏈孢屬(Alternaria)、小叢殼屬(Glomerella)、擬莖點霉屬(Phomopsis)及莖點屬(Phoma)等，則可配制成孢子懸浮液,以稀釋法或劃線法分離。現在是42頁\一共有59頁\編輯于星期二43

許多真菌的孢子在成熟時有彈射的作用，這樣就可以將產生孢子的材料，放在瓊脂培養基平板的下面或者懸掛在上面，便孢子彈射在培養基上而得到純培養。現在是43頁\一共有59頁\編輯于星期二44典型的是擔子菌亞門大型真菌擔孢子的分離和獲得：擔孢子無色或有色，淺色的擔孢子需要成團堆積時方能辨識，一般是依靠“孢子印”。現在是44頁\一共有59頁\編輯于星期二45

為了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，從有病的土壤中分離它們是必要的。分離方法是將土壤取出少許，配制成懸浮液，然后用稀釋法或劃線法分離。4.2.2土壤帶菌分離法

現在是45頁\一共有59頁\編輯于星期二46稀釋倒平板法示意圖現在是46頁\一共有59頁\編輯于星期二47稀釋涂布法示意圖現在是47頁\一共有59頁\編輯于星期二481.dilutesample1ml9ml1010010001041051061072.plateout0.1ml平板稀釋法現在是48頁\一共有59頁\編輯于星期二49圖平板劃線分離法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法現在是49頁\一共有59頁\編輯于星期二50平板劃線方法示意圖現在是50頁\一共有59頁\編輯于星期二51

分離真菌時經常有細菌污染。將培養基調節至酸性反應，如在10ml培養基中加1-2滴25%的乳酸，可使大部分細菌受到抑制，而并不影響真菌的生長。4.3細菌污染的排除現在是51頁\一共有59頁\編輯于星期二52培養基中加適當的抗菌素是抑制細菌生長很有效的方法。加金霉素(30ug/ml)可抑制多數細菌的生長，加青霉素(20ug/ml)可抑制革蘭氏陽性細菌的生長，加多粘霉素B(5.0ug/ml)可抑制G—陰性細菌的生長，加鏈霉素(40ug/ml)或氯霉素(50ug/ml)可以抑制大部分細菌的生長。除去氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應在培養基滅菌后并冷卻到45℃左右時加入(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)。

現在是52頁\一共有59頁\編輯于星期二535、內生真菌的分離

先將健康組織，如：葉片和莖，用自來水沖洗干凈、晾干水分后,剪成約1.5cm×1.5cm的小片(葉)或1.5cm長的小段(莖)。按下列程序進行表面消毒:70%酒精漂洗30s→0.1%升汞漂洗1min→70%酒精漂洗30s→無菌水沖洗4次，在無菌濾紙上吸干水分。將上述處理過的材料在無菌狀態下剪切成0.5cm×0.5cm小片（剪去0.5cm的邊緣），或0.3~0.5cm長段移植于含鏈霉素的供試培養基上（PDA、Czapek、煎汁培養基）,于26±1℃黑暗條件下培養，待組織塊邊緣有菌絲長出后，及時挑取菌絲尖端轉入PDA平板上培養。現在是53頁\一共有59頁\編輯于星期二54

用絲瓜誘發瓜果腐霉：Pythiumaphanidennatum6、土壤真菌的誘發技術與步驟：

E、進一步純化，保存備用。D、在25℃下放置4-5天后，瓜上長出大量白色棉絮狀的菌絲體，即為所需真菌。C、將絲瓜切段，切口端插入土中。B、加入少量自來水，將菜園土混合成糊狀。A、將菜園土裝于玻璃杯中（約半杯）現在是54頁\一共有59頁\編輯于星期二551）先用剪刀將每粒大麻籽一分為二，然后在水中煮沸，進行簡單滅菌。7、水生真菌的誘發技術與步驟：4）進一步純化，保存備用。3）2天后開始換水，即將培養皿中的混合水全部倒掉，再加入約15ml滅菌水，以后每天換滅菌水一次，一般4-5天后即可從大