植物原生質體融合技術演示文稿現在是1頁\一共有65頁\編輯于星期二微絲葉綠體線粒體質膜液泡細胞核內質網微管細胞壁高爾基體植物細胞模式圖細胞壁由三種主要成分構成纖維素25-50%、半纖維素53%和果膠5%現在是2頁\一共有65頁\編輯于星期二◆What基本原理◆去除植物細胞壁以獲得大量的原生質體◆誘導原生質體融合形成雜種細胞◆篩選，培養，促進雜種細胞分裂，分化◆從細胞團，愈傷組織到最后成株現在是3頁\一共有65頁\編輯于星期二現在是4頁\一共有65頁\編輯于星期二◆Why技術應用植物原生質體融合的意義：◆克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙◆為攜帶外源遺傳物質的大分子滲入細胞創造條件現在是5頁\一共有65頁\編輯于星期二◆How技術方法現在是6頁\一共有65頁\編輯于星期二第16章植物原生質體融合技術PlantProtoplastFusion植物原生質體的制備植物原生質體的培養植物原生質體的融合現在是7頁\一共有65頁\編輯于星期二一、植物原生質體的制備原生質體的概念及培養的意義原生質體材料來源原生質體的分離原生質體的純化現在是8頁\一共有65頁\編輯于星期二1、原生質體的概念及培養的意義概念：除去植物細胞壁的裸露細胞，稱為原生質體意義：（1）植物原生質體，具有再生完整植株的力。（2）為細胞融合研究提供了可能。有可能產生異源雜交新品種。（3）由于除去了細胞壁，降低了細胞的DNA酶活性，從而有助于外源DNA的進入。為再生成具有新性狀的植物體提供有利條件。（4）是開展遺傳理論研究的材料。現在是9頁\一共有65頁\編輯于星期二植物原生質體在理論研究和細胞工程中的地位信息傳遞、能量轉換細胞壁合成機理膜的結構與功能核質關系雜交或自交不親和的機理細胞間的相互作用植物激素的作用機理融合產生體細胞雜種分離各種細胞器引入各種細胞器導入外源基因誘發突變體現在是10頁\一共有65頁\編輯于星期二純化后的葉肉原生質體現在是11頁\一共有65頁\編輯于星期二2、原生質體材料來源★植物葉片－取材容易－比較容易用酶解法分離★植物根尖組織－可由各種植物的種子萌發后取得★植物花粉－產生單倍體原生質體★愈傷組織、懸浮培養的細胞－細胞壁容易解離現在是12頁\一共有65頁\編輯于星期二3、原生質體的分離現在是13頁\一共有65頁\編輯于星期二A、原生質體的分離方法★機械分離法－先將細胞放在高滲溶液中預處理，待細胞發生輕微質壁分離，原體質體收縮成球形式，再用機械法磨碎細胞，從傷口處可以釋放出完整的原生質體。－優點：該方法可避免酶制劑對原生質體的破壞作用。－缺點：獲得完整的原生質體的數量比較少。★酶解分離法 常用的細胞壁降解酶種類：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、果酸酶等

優點：可以獲得大量的原生質體，而且幾乎所有的植物或它們的器官組織或細胞均可用酶解法獲得原生質體。

缺點：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質。影響所獲原生質體的活力。現在是14頁\一共有65頁\編輯于星期二B、影響原生質體數量和活力的因素1）不同種類植物或不同組織和細胞，其細胞壁的組成和結構有差異2）滲透壓穩定劑：如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、鹽類（KCl,MgSO4.7H2O)等3）質膜穩定劑：如葡聚糖硫酸鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀等增加對質膜的穩定性4）酶液的pH值：一般在5）溫度因子6）植物材料的生理狀態：如株齡、發育狀態、栽培條件等對取材影響很大現在是15頁\一共有65頁\編輯于星期二C、分離原生質體所用的酶液和穩定劑▲煙草葉肉細胞：0.5%MacerozymeR-10果膠酶+2%OnozukaR-10纖維素酶，0.7M甘露醇。▲煙草懸浮細胞：

2%Driselase纖維素酶+2%Cellusase纖維素酶+0.5%Macerozyme果膠酶；海水。▲胡蘿卜懸浮培養的細胞：2%Onozuka纖維素酶+0.5%Driselase纖維素酶+0.5%Rhoxyme半纖維素酶1%Pectinase果膠酶；0.35M甘露醇+0.35M山梨醇▲甘藍等的根細胞：4%Maicelase纖維素酶+2%Rhozyme半纖維素酶+0.3%Macerozyme果膠酶；0.7M甘露醇。▲番茄無菌苗的子葉和葉肉細胞：1.5%Cellulysin纖維素酶+0.3%Macerozyme果膠酶；102.6g/L蔗糖。▲水稻種子的愈傷組織的懸浮培養細胞：2%OnozukaRs纖維素酶+1%Driselase纖維素酶+2%MacerozymeR-10果膠酶+1%Pectolyase果膠酶；0.3M葡萄糖現在是16頁\一共有65頁\編輯于星期二4、原生質體的純化去除破碎的原生質體、末去壁的細胞、細胞器及其他碎片等雜質A、過濾法B、漂浮法C、離心法現在是17頁\一共有65頁\編輯于星期二例:煙草葉肉細胞原生質體的分離1).材料的準備與消毒：2).酶解：3).純化：4).原生質體的活力測定現在是18頁\一共有65頁\編輯于星期二1).材料的準備與消毒選取在溫室中生長兩個月左右的煙草植株從生長健康的植株上摘取充分展開的嫩葉片經自來水沖洗干凈后放入70%乙醇中進行表面消毒然后再放入2%次氯酸鈉溶液中處理10分鐘接著用無菌水洗滌3～4次，以充分除去消毒劑現在是19頁\一共有65頁\編輯于星期二2).酶解

用一把尖鑷子，小心撕去葉片的下表皮，將葉片切成2cm長的小片，然后放入含酶溶液中處理。（注意：使撕去表皮的一面朝下，溫度25～28℃下經3-4小時的酶解反應，其間輕輕搖動培養皿若干次）現在是20頁\一共有65頁\編輯于星期二3).純化

將酶解懸浮液通過300-400目網，以除去大的未消化的碎片 然后將含有原生質體的酶液收集在離心管中，低速離心，使原生質體沉于管底，傾去上清液 在離心管中加入適量洗滌液，再離心；重復此步驟3次，使酶解液充分除去； 最后用原生質體培養液離心一次現在是21頁\一共有65頁\編輯于星期二分離、洗滌、純化原生質體

的試劑試劑分離洗滌純化KH2PO427.2mgKNO3101mgCaCl2.2H2O1480mgMgSO4.7H2O240mgKI0.16mgCuSO4.5H2O0.025mg甘露醇13%纖維素酶4%果膠酶0.4%蔗糖----21%pH5.65.65.6與分離試劑相同與分離試劑相同現在是22頁\一共有65頁\編輯于星期二4).原生質體的活力測定

形態： 把形態上完整，富含細胞質，顏色新鮮的原生質體釋放到降低滲透壓濃度的洗滌液或培養基中，即可見到分離后縮小的原生質體會恢復原態，成為正常膨大的一般是有活力的原生質體。 染色法： 用0.1%酚藏花紅液染色，活的原生質體能著紅色 用熒光素雙醋酸酯（FDA）染色，在熒光顯微鏡下觀察到帶有熒光的是有活力的原生質體現在是23頁\一共有65頁\編輯于星期二FDA法的原理FDA本身不具有極性，不能發出熒光，可以自由出入細胞膜。在活細胞中，FDA被酯酶裂解，釋放出有極性的熒光素。熒光素不能自由穿越質膜，在活細胞中積累。熒光素在死細胞中不能積累。在UV照射下，活細胞中的熒光素發出綠色熒光。現在是24頁\一共有65頁\編輯于星期二FDA熒光素活細胞死細胞請思考活細胞死細胞FDA先用丙酮配成0.5%的母液，終濃度為0.01%現在是25頁\一共有65頁\編輯于星期二原生質體分離純化流程圖現在是26頁\一共有65頁\編輯于星期二第16章植物原生質體融合技術PlantProtoplastFusion植物原生質體的制備植物原生質體的培養植物原生質體的融合現在是27頁\一共有65頁\編輯于星期二二、植物原生質體的培養1、原生質體的培養方法2、原生質體培養程序3、原生質體培養成功的技術關鍵現在是28頁\一共有65頁\編輯于星期二固體培養法 原生質體按照一定細胞起始密度，均勻分布于薄層固體培養基中 此法優點有利于對單個原生質體的胞壁再生和對細胞團形成的全過程進行定點觀察淺層液體培養法：

在培養皿或三角瓶中注入3~4ml原生質體培養液，然后將純凈的原生質體，按一定的細胞密度注入并進行培養雙層培養法

在固體培養基上，加入適宜原生質體胞壁再生和細胞分裂的液體培養基1、原生質體的培養方法現在是29頁\一共有65頁\編輯于星期二現在是30頁\一共有65頁\編輯于星期二2、原生質體的培養程序

細胞壁再生： 體積膨大，葉綠體重新排列，新的細胞壁開始合成，細胞由球形變成橢圓形。 細胞分裂形成細胞團： 一般在培養2-3天后細胞質增加，細胞器增殖，DNA、蛋白質等合成增加，細胞分裂，形成小的細胞團，發育成愈傷組織或胚狀體。 器官形成植株再生： 從愈傷組織誘導發生 胚狀體發育現在是31頁\一共有65頁\編輯于星期二現在是32頁\一共有65頁\編輯于星期二3、原生質體培養成功的技術關鍵原生質體的活力 影響因素：制備原生質體的方法，滲透壓穩定劑種類、濃度，質膜穩定劑種類、濃度，溫度和保溫時間原生質體密度 起始密度一般為104-105個/mL細胞壁再生速度 植物種類和取材的生理狀態；培養細胞所處的時期；酶解時所用質膜穩定劑種類原生質體培養的營養和環境 培養基 原生質體培養的環境：光照、溫度、濕度現在是33頁\一共有65頁\編輯于星期二第16章植物原生質體融合技術PlantProtoplastFusion植物原生質體的制備植物原生質體的培養植物原生質體的融合現在是34頁\一共有65頁\編輯于星期二回顧：動物細胞融合技術簡介◆親本的來源◆融合方法◆融合細胞的篩選◆融合細胞的克隆◆融合細胞的鑒定現在是35頁\一共有65頁\編輯于星期二三、植物原生質體的融合1、植物細胞融合的概念和意義2、植物細胞融合的程序3、誘導細胞融合的方法及融合劑4、細胞融合的影響因素5、細胞雜種的選擇和鑒定現在是36頁\一共有65頁\編輯于星期二1、植物細胞融合的概念和意義細胞融合(cellfusion)概念： 又稱細胞雜交(cellhybridizaion)：離體條件下用人工的方法把不同的細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術。細胞融合的意義： 克服種、屬以上植物有性雜交不親和性障礙 為攜帶外源遺傳物質的大分子滲入細胞創造條件現在是37頁\一共有65頁\編輯于星期二現在是38頁\一共有65頁\編輯于星期二2、植物細胞融合的程序◆原生質體分離的分離、純化◆融合方法選擇◆雜種細胞的篩選◆愈傷組織形成器官分化植株再生◆雜種植物的鑒定現在是39頁\一共有65頁\編輯于星期二3、誘導原生質體融合的方法及融合劑◆鹽類融合法◆高Ca2+和高pH值融合◆聚乙二醇（PEG）融合法◆PEG與高Ca2+和高pH值結合融合法◆電融合法現在是40頁\一共有65頁\編輯于星期二回顧：誘導動物細胞融合的方法1、病毒誘導細胞融合2、化學融合劑誘導細胞融合3、電融合法現在是41頁\一共有65頁\編輯于星期二A.鹽類融合法鹽類融合劑種類硝酸鹽類：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2氯化物類：NaCl、CaCl2、MgCl2、BaCl2葡聚糖硫酸鹽類：葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉鹽類融合的優缺點優點：鹽類融合劑對原生質體的活力破壞力小缺點：融合頻率低，對液泡化發達的原生質體不易誘發融合現在是42頁\一共有65頁\編輯于星期二B.高Ca2+和高pH值融合Ca2+濃度0.05mol/L現在是43頁\一共有65頁\編輯于星期二具體做法(以煙草為例)取分離、純化好的兩種親本原生質體以1:1的比例混合;加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇;再用甘氨酸鈉緩沖pH值到10.5，成為融合液，同時在37℃下保溫0.5h;用0.4mol/L甘露醇洗凈高CaCl2和高pH值；兩種原生質體的融合率達到10%。現在是44頁\一共有65頁\編輯于星期二C.聚乙二醇（PEG）融合法Polyethyleneglycol(PEG)是一種多聚化合物,分子式H(OHCH2-CH2)nOH,平均相對分子量200-20000之間融合機制：可能是由于帶有大量負電荷的PEG分子和原生質體表面的負電荷間在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質體間的粘著結合用相對分子質量為1540的PEG處理40-50min；再用培養液緩慢稀釋PEG最后洗去PEG，得到10%的異核體現在是45頁\一共有65頁\編輯于星期二D.PEG與高Ca2+和高pH值結合融合法先用PEG處理30min；（PEG是相鄰原生質體表面間的分子橋）然后用高Ca2+和高pH值液，稀釋PEG；（引起原生質體表面電荷的紊亂和再分布，從而促進了融合）再用培養液洗去高Ca2+和高pH值現在是46頁\一共有65頁\編輯于星期二PEG誘導原生質體融合過程現在是47頁\一共有65頁\編輯于星期二E.電融合法原理： 改變原生質體質膜表面的電荷和氧化還原電位發生改變，使異種原生質體粘合并發生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。優點： 對原生質體的損害小，融合率高，重復性強；裝置精巧、方便簡單，可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程，免去PEG誘導后的洗滌過程，誘導過程可控性強。現在是48頁\一共有65頁\編輯于星期二現在是49頁\一共有65頁\編輯于星期二電融合基本過程將制備好的親本原生質體均勻混合放入融合小室，微電極型只有一個小室，平行電極型有4個小室，兩電極間隔3mm，整個裝置放在一個培養皿中微電極型：用5-12微安的脈沖電流間斷刺激1-5毫秒，原生質體在幾秒到幾十秒鐘的時間內會發生暫時性的收縮，兩層膜之間形成小孔，連接成橋，形成一個個泡囊，經點連接到面連接，最后形成融合體,整個過程約10-30分平行多電極融合裝置法：經過1兆赫如150V/cm交流電場發生雙向電脈沖，原生質體在電場力的作用下，極化產生偶極子，原生質體緊密排開成串珠狀。在適當時間和強度的直流電脈沖(50ms,1.2-2KV/cm)作用下，質膜發生被擊穿，進一步形成融合體現在是50頁\一共有65頁\編輯于星期二細胞電融合過程現在是51頁\一共有65頁\編輯于星期二現在是52頁\一共有65頁\編輯于星期二原生質體的融合過程包括3個主要階段：1)兩個或多個原生質體的質膜彼此靠近；2)局部區域質膜緊密粘連，彼此融合；3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。現在是53頁\一共有65頁\編輯于星期二4、細胞融合的影響因素PEG誘導法：PEG規格、純度，作用時間電誘導法：原生質體密度交流電壓交變電場的振幅頻率交變電場的處理時間直流高頻電壓脈沖寬度脈沖次數現在是54頁\一共有65頁\編輯于星期二5、雜種細胞的選擇和鑒定A、融合體的類型B、雜種細胞選擇的方法C、細胞雜種的鑒定現在是55頁\一共有65頁\編輯于星期二A、融合體的類型自體融合：發生在親本原生質體自身異體融合諧和的細胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體部分諧和的細胞雜種：雙親的染色體經逐步排斥，便發生少量染色體的重組，然后進入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株異胞質體細胞雜種：親本的染色體全部被排斥，但胞質是雙親的嵌合細胞雜種：不同種的雙親原生質體，發生了膜融合和胞質融合，尚未發生核融合。雙親的細胞核各自發生核分裂，接著形成細胞壁，最終形成嵌合體植物現在是56頁\一共有65頁\編輯于星期二B、雜種細胞選擇的方法互補選擇法(遺傳或抗性)： 選擇一個葉綠體缺失突變體，這一突變體在限定培養基上，能分裂、分化形成植株。具有正常葉綠素的植株，在上述限定培養基上，則不能分裂形成大細胞團（愈傷組織）可見標記法： 凹穴培養皿分離法：根據融合后異核體和親本原生質體的形態特征之區別 微吸管分離法：用一種向吸管根據可見標記吸取異核體，進行“看護培養”，以獲得雜種植物現在是57頁\一共有65頁\編輯于星期二生長特性選擇法：利用原生質體對培養基成分要求與反應的差異選擇雜種細胞。物理特性選擇法：利用親本原生質體大小、顏色、漂浮密度及電脈差異率等差異選擇雜種。其他方法：如采用顯微操作技術也能把單個異核體分離出來進行培養。現在是58頁\一共有65頁\編輯于星期二異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發出綠色和紅色◆熒光染料法兩個親本原生質體在融合前用能發不同顏色熒光的熒光染料進行染色。細胞分類器辨別和收集發兩種熒光的異核體。但儀器價格昂貴，不常用。現在是59頁\一共有65頁\編輯于星期二現在是60頁\一共有65頁\編輯于星期二現在是61頁\一共有65頁\編輯于星期二C、細胞雜種的鑒定（1）雜種植物形態特征、特性鑒定（2）雜種植物的核型分析（3）同工酶分析（4)分子標記鑒定：RFLP鑒定、RAPD 標記鑒定現在是62頁\一共有65頁\編輯于星期二幾種細胞融合成功的例子融合生物種類細胞來源成功年代煙草兩個種間葉——葉1972甘藍——青菜葉——根1972大豆——馬唐草愈傷組織——葉197