課前檢測1.什么是目的基因？2.篩選合適的目的基因的方法？3.獲取目的基因的方法4.PCR反應的原理、所需要的條件？5.什么是引物？引物的作用6.Mg2+的作用。蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因導入Bt基因重組DNA分子培育轉基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構建（核心）3.將目的基因導入受體細胞4.目的基因的檢測與鑒定第2課時：步驟二、三、四第三章第2節基因工程的基本操作程序學習目標1.說出基因表達載體的組成。2.列舉將目的基因導入植物細胞、動物細胞和微生物細胞的方法。3.列舉檢測與鑒定目的基因在受體細胞中是否穩定維持和表達其遺傳特性的方法。4.能夠用流程圖的形式概括出基因工程的基本操作程序。獲得目的基因后直接轉入受體嗎？不是，游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉錄和翻譯成蛋白質，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復制，導致子代細胞不再含有目的基因。2.基因表達載體的構建基因表達載體的構建是基因工程的核心工作。1.構建基因表達載體的目的：（1）使目的基因在受體細胞中穩定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細胞中表達和發揮作用。一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的識別和結合位點，啟動轉錄過程。一段特殊DNA序列，位于基因的上游，終止轉錄。篩選含目的基因(重組DNA分子)的受體細胞基因表達載體構建模式圖

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。限制酶①識別序列GAATTCCTTAAG限制酶②識別序列CCCGGGGGGCCC

...CATGCTATCCATGAATTCATC...GAATTCCCGGGTCAT…...GTACGATAGGTACTTAAGTAG...CTTAAGGGCCCAGTA…1.只由一種酶①切割思考1：只用一種限制酶切割的時候會出現什么現象？質粒重新環化、目的基因自身環化質粒與目的基因反向連接

CCGGGTCAT…

CAGTA…限制酶①識別序列限制酶②識別序列1.由兩種酶①、②切割GAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCC

AATTCATC...GAATTC

GTAG...CTTAAGGGCC

...CATGCTATCCATG...GTACGATAGGTACTTAA使用兩種限制酶的優點：①防止目的基因和載體的自身環化②還可以防止目的基因與載體的反向連接思考2.如何防止目的基因和載體的自身環化以及目的基因的反向連接？雙酶切①獲取目的基因和切割載體時，通常使用同種限制酶,目的是為了產生相同的黏性末端，便于連接，也可以使用能產生相同黏性末端的兩種限制酶。②使用雙酶切的優點：使目的基因定向插入載體，避免目的基因和載體自身環化。

1.根據目的基因兩端的限制酶切割位點、質粒上的限制酶切割位點以及是否破壞目的基因和標記基因等來確定限制酶的種類。拓展：限制酶的選擇方法(1)應選擇酶切位點位于

的限制酶，如圖甲可選擇

；不能選擇酶切位點位于

的限制酶，如圖甲不能選擇

。(2)為避免目的基因及質粒的

，也可使用

的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和質粒(雙酶切)，如圖甲可選擇用

兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的

)。目的基因兩端PstⅠ目的基因內部SmaⅠ自身環化、反向連接不同PstⅠ和EcoRⅠ切割位點拓展：限制酶的選擇方法

(3)切割質粒的限制酶不能同時切開質粒上的所有標記基因，即至少要保留一個標記基因，以用于重組DNA的鑒定和篩選，如圖乙中的質粒不能使用

切割。（同理保留啟動子、終止子、復制原點）（4）目的基因需要插入

之間。SmaⅠ啟動子和終止子（1）花粉管通道法（我國科學家獨創）方法2：在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因適用生物：開花植物三、將目的基因導入受體細胞（2）農桿菌轉化法

轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。實質是基因重組。1.目的基因導入植物細胞農桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。（可轉移的DNA）關于農桿菌農桿菌細胞內含有Ti質粒，當它侵染植物細胞后，能將Ti質粒上的T-DNA轉移到被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。目的基因Ti質粒表達載體農桿菌植物細胞植物細胞染色體DNA新性狀植株構建轉入導入插入表達（2）農桿菌轉化法1.目的基因導入植物細胞1.農桿菌轉化法中兩次拼接、兩次導入的辨析(1)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。(2)兩次導入：第一次導入是將含目的基因的重組Ti質粒導入農桿菌；第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導入受體細胞。核心歸納核心探討

將目的基因導入受體細胞下面為利用農桿菌轉化法制備轉基因植物的過程圖，據圖回答下列問題：1.重組Ti質粒的構建需要哪些酶的作用？限制酶、DNA連接酶。2.將基因表達載體導入農桿菌細胞時，應怎樣處理農桿菌細胞？要用Ca2＋處理農桿菌細胞，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。在棉花細胞中，重組表達載體是否導入成功？是否可以穩定維持并表達出Bt蛋白？表達出的Bt蛋白是否具有殺蟲的功效？目的

檢測目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性檢測內容及方法

類型檢測內容方法分子水平的檢測個體生物學水平的鑒定受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉錄出了mRNAPCR等技術目的基因是否翻譯成蛋白質抗原-抗體雜交技術個體是否具有相應性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等四、目的基因的檢測與鑒定PCR擴增轉基因生物提取DNADNA作為模板PCR操作是否擴增出目的基因電泳操作M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉Bt品系；轉Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果抗原-抗體雜交技術蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交脫分化個體生物學水平的鑒定——個體是否具有相應性狀方法：抗蟲鑒定、抗病鑒定、抗蟲或抗病接種實驗與天然產品的功能進行活性比較接種棉鈴蟲觀察性狀表現，或采摘抗蟲棉的葉子飼喂棉鈴蟲，觀察抗蟲效果。外源基因在受體細胞中能表達的原因(基因工程得以實現的理論基礎)：②基因是控制生物性狀的基本遺傳單位，其表達具有一定的獨立性，不同生物的基因在表達時都遵循“中心法則”，在受體細胞內定向表達；(前提條件)①不同生物的DNA分子的結構基本相同，都以4種脫氧核苷酸為基本組成單位，具有獨特的雙螺旋結構(物質基礎)；③所有生物共同一套遺傳密碼。(表達提供可能)1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？

科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。2.科研工作者在沒有發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白