第3章基因工程第1節

重組DNA技術的基本工具SW-PWF1961年，尼倫伯格（M.W.Nirenberg,1927-2010)和馬太（J.H.Matthaei，1929一）破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。截至1966年，64個密碼子均被成功破譯。1967年，科學家發現，在細菌擬核DNA之外的質粒有自我復制能力，并可以在細菌細胞間轉移。1958年，梅塞爾森（M.Meselson,1930-)和斯塔爾（F.W.Stahl,1929-)用實驗證明了DNA的半保留復制。隨后不久，克里克提出中心法則。1953年，沃森（J.D.Watson,1928-)和克里克（F.Crick,1916-2004)建立了DNA雙螺旋結構模型并提出了遺傳物質自我復制的假說。1950年，埃德曼（P.V.Edman,1916-1977)發明了一種測定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger,1918-2013)首次完成了對胰島素氨基酸序列的測定。1944年，艾弗里（O.Avery,1877-1955)等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉移。科技探索之路基因工程的誕生和發展1953195819441950196119671977年，桑格等科學家發明了DNA序列分析的方法，為基因序列圖的繪制提供了可能。此后，DNA合成儀的問世為體外合成DNA提供了方便。1982年，第一個基因工程藥物－重組人胰島素被批準上市。基因工程藥物成為世界各國研究和投資開發的熱點。1973年，科學家證明質粒可以作為基因工程的載體，構建重組DNA,導入受體細胞，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。1972年，伯格（P.Berg,1926-)首先在體外進行了DNA改造的研究，成功地構建了第一個體外重組DNA分子。20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶被相繼發現。這些發現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。1970年，科學家在細菌中發現了第一個限制性內切核酸酶（簡稱限制酶）19721973197020世紀70年代初19771982科技探索之路基因工程的誕生和發展21世紀以來，科學家發明了多種高通量測序技術，可以實現低成本測定大量核酸序列，加速了人們對基因組序列的了解。2013年，華人科學家張鋒（1982-)及其團隊首次報道利用最新的基因組編輯技術－CRISPR(成簇規律間隔短回文重復）技術編輯了哺乳動物基因組。該技術可以實現對特定基因的定點插入、敲除或替換。1990年，人類基因組計劃啟動。2003年，該計劃的測序任務順利完成1985年，穆里斯（K.Mullis,1944-2019)等人發明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。1984年，我國科學家朱作言（1941-)領導的團隊培育出世界上第一條轉基因魚。1983年，科學家采用農桿菌轉化法培育出世界上第一例轉基因煙草。此后，基因工程進入了迅速發展的階段。198519901983198421世紀以來2013科技探索之路基因工程的誕生和發展基因工程發展歷程1944年艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉化實驗，不僅證明了遺傳物質是DNA，還證明了DNA可以在同種生物個體間轉移。1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。截至19666年，64個密碼子均被破譯成功。1970年科學家在細菌中發現了第一個限制性核酸內切酶（簡稱限制酶）1972年，伯格首先在體外進行了DNA的改造，成功構建了第一個體外重組DNA分子。1982年，第一個基因工程藥物-重組人胰島素被批準上市。基因工程藥物成為世界各國研究和投資開發的熱點。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結構模型并提出了遺傳物質自我復制的假說。1967年，科學家發現，在細菌擬核DNA之外的質粒有自我復制能力，并可以在細菌細胞間轉移。20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶被相繼發現。這些發現為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創造了條件。1973年，科學家證明了質粒可以作為基因工程的載體，構建重組DNA，導入受體細胞，使外源基因在原核細胞中成功表達，并實現了物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。1985年，穆里斯等人發明PCR,為獲取目的基因提供了有效手段。基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。什么是基因工程？甲生物取出優秀基因“剪切”“拼接”

乙生物表達

新類型新的生物產品什么是基因工程？別名操作環境操作對象操作水平結

果原理優點重組DNA技術生物體外基因符合人類需要的新的生物類型和生物產品對基因工程概念的理解基因重組克服遠緣雜交不親和障礙、定向改造生物性狀DNA分子水平理論基礎DNA的基本組成單位相同(都是四種脫氧核苷酸)都遵循堿基互補配對原則DNA分子的空間結構都是規則的雙螺旋結構理論基礎基因是控制生物性狀的結構與功能單位遺傳信息傳遞都遵循中心法則所有生物幾乎共用一套遺傳密碼基因工程的理論基礎復制從社會中來番木瓜容易受番木瓜環斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計，用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？轉基因番木瓜（左）與非轉基因番木瓜（右）科學家用到了限制酶、DNA連接酶、載體等“分子工具”。限制酶能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并將DNA雙鏈切斷，形成具有黏性末端或平末端的片段。DNA連接酶催化磷酸二酯鍵的形成，即催化一個DNA片段3'端的羥基與另ー個DNA片段5'端的磷酸基團上的羥基連接起來形成酯鍵。載體上可以插入外源基因，它能攜帶該基因進入受體細胞，并在受體細胞中進行自我復制，或者整合到受體DNA上，隨著受體DNA同步復制。載體一般還帶有標記基因，以便進行重組DNA分子的篩選。培育抗番木瓜環斑病毒的木瓜抗番木瓜環斑病毒基因提取抗番木瓜環斑病毒基因與載體DNA連接抗番木瓜環斑病毒基因導入受體細胞“分子手術刀”“分子縫合針”“分子運輸車”準確切割DNA分子將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導入受體細胞重組DNA技術的基本工具一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”1.簡稱：

。限制酶2.來源：主要是從

中分離純化出來的。3.種類：

種。4.特點：識別

的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的

斷開。原核生物數千雙鏈DNA分子磷酸二酯鍵5.作用部位：

磷酸二酯鍵限制酶不是一種酶，而是一類酶特異性一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”1’2’3’4’5’

G1’2’3’4’5’

A磷酸二酯鍵TGCCGTAA5'3'5'3'你能根據所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身安全。試推測限制酶為什么不會切割自身的DNA？原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已被修飾旁欄思考題一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”6.識別序列長度:

大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。限制酶(EcoRⅠ)能識別

序列，并在

和

之間切開

鍵,形成

末端。-GAATTC--CTTAAG-GA黏性磷酸二酯EcoRI5'5'3'3'黏性末端當限制酶從識別序列的中心軸線兩側將DNA兩條單鏈分別切開，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”6.識別序列長度:

大多數限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數限制酶的識別序列由4個、8個或其他數量的核苷酸組成。SmaI5'5'3'3'平末端限制酶(SmaⅠ)能識別

序列，并在

和

之間切割形成

末端。-CCCGGG--GGGCCC-GC平7.作用結果:形成黏性末端和平末端當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。一、限制性內切核酸酶——“分子手術刀”8.識別序列的特點：(2)限制酶所識別的序列，呈堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的。(1)限制酶具有專一性。一種限制酶一般只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子。(3)同一種限制酶一定能切出相同的粘性末端，相同的粘性末端不一定來自用一種限制酶的切割，但同樣能相互連接。回文序列BamHⅠ

;EcoRⅠ

;HindⅢ

;BglⅡ

。寫出下列限制酶切割形成的黏性末端GATCAATTAGCTGATC判斷1：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端（

）學以致用以下黏性末端是由_____種限制酶作用產生的3判斷2：相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的（

）√√限制酶名字的由來資料卡是用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一個限制酶:

。粘質沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一個限制酶:

。EcoRⅠSmaⅠ練習：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:

。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ……CTACGATGAATTCC..........GTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCAT..........CTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCC..........GTAGGGCAT..........CTTAA黏性末端目的基因用EcoRI剪切目的基因1.要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性(平)末端？2.如果把兩種來源不同的DNA用同種限制酶來切割，會怎樣？要切2個切口，產生4個黏性(平)末端。會產生相同的黏性(平)末端……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因用EcoRI剪切目的基因TCTTCATGAGAAGTACTTAAAATTCCCTAAGGGGATTC如何將不同種來源的DNA片段連接起來？二、DNA連接酶——“分子縫合針”2.作用：將

“縫合”起來，恢復被

切開的兩個核苷酸之間的__________。雙鏈DNA片段限制酶磷酸二酯鍵1.概念：能夠將

連接起來的酶，稱之為DNA連接酶。兩個DNA片段3.種類和差別：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源________________________功能只縫合____________縫合____________和____________結果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的_________________大腸桿菌T4噬菌體黏性末端黏性末端平末端(效率較低)磷酸二酯鍵旁欄思考題DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?DNA連接酶AG

T

AC

TA

A

T

DNA母鏈DNA聚合酶DNA聚合酶T……T……A……A……T……A……T……C………G………旁欄思考題項目DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA連接酶和DNA聚合酶功能比較只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵總結歸納幾種相關酶的比較名稱作用部位作用結果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈根據所學知識，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵學以致用三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”1.作用：2.種類：將

送入受體細胞，在受體細胞內對目的基因進行大量復制。

外源基因在基因工程中使用的載體包括

等。質粒、噬菌體和動植物病毒種類用途不同點質粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因導入大腸桿菌等受體細胞將外源基因導入植物細胞將外源基因導入動物細胞它們來源不同，在大小、結構、復制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別動物病毒噬菌體三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”3.常用載體：質粒擬核DNA質粒大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因目的基因插入位點復制起點大腸桿菌及質粒結構模式圖(1)化學本質：是一種裸露、結構簡單、獨立于

或________________外，具有

能力的

。真核細胞細胞核原核細胞擬核DNA自我復制環狀雙鏈DNA(2)基因工程中使用質粒的特點：在基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是天然質粒的基礎上進行過__________

的。人工改造三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”4.作為載體需具備的條件：擬核DNA質粒大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因目的基因插入位點復制起點大腸桿菌及質粒結構模式圖(1)有一個至多個

，供外源DNA片段（基因）插入其中。限制酶切割位點(2)能夠在宿主細胞中

或整合到

上，隨受體DNA同步

。自我復制受體DNA復制(3)具有特殊的

，便于重組DNA分子的

。標記基因篩選(4)對受體細胞無害、易分離，大小合適、方便操作。標記基因通常有：①抗生素的抗性基因，如：抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環素基因(tetr)。②熒光蛋白基因，如：綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)。重組DNA分子請你在上述序列中EcoRⅠ的識別序列和切割位點。然后，用剪刀進行“切割”。待切割位點全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠帶將切口粘起來。思考·討論重組DNA分子思考·討論討論：剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？根據學生實際操作的情況進行指導。如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。目的基因和載體隨意連接（反向連接）、目的基因自身環化4.用同一種限制酶切割目的基因和載體在連接過程中可能出現什么問題？隨著生物技術的飛速發展，生產和消費“分子工具”的公司大量涌現。感興趣的話，你可以登錄這些公司的網站，查詢和了解相關產品的特點、價格和使用說明等。有些這樣的公司已經上市，你還可以通過分析公司的股票價格走勢，大致了解公司的運營狀況以及投資者目前對該行業的認可程度。在調查中需要了解企業的生產技術、產品的種類和產量、銷售渠道和銷售情況等，這樣才有可能對企業的經營狀況進行正確的判斷。到社會中去限制酶DNA連接酶載體①對受體細胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標記基因；④能自我復制或能整合到宿主DNA上。質粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類：磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

課堂小結1.

DNA連接酶是重組DNA技術常用的一種工具酶。下列相關敘述正確的是（

）A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.

能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.

能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.

只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端2.在重組DNA技術中，將外源基