PAGEPAGE14復習資料酶生物合成中的轉錄與翻譯酶合成中的轉錄是指以核苷三磷酸為底物，以DNA鏈為模板，在RNA聚合酶的作用下合成RNA分子。酶合成中的翻譯是指以氨基酸為底物，以mRNA為模板，在酶和輔助因子的共同作用下合成蛋白質的多肽鏈。誘導與阻遏酶合成的誘導是指加入某種物質使酶的合成開始或加速進行的過程；酶合成的阻遏作用則是指加入某種物質使酶的合成中止或減緩進行的過程。這些物質分別稱為誘導物及阻遏物。酶回收率與酶純化比（純度提高比）酶的回收率是指某純化步驟后酶的總活力與該步驟前的總活力之比。酶的純化比是之某純化步驟后的酶的比活力與該步驟前的比活力之比。酶的變性與酶的失活酶的變性是指酶分子結構中的氫鍵、二硫鍵及范德華力被破壞，酶的空間結構也受到破壞，原來有序、完整的結構變成了無序，松散的結構，失去了原有的生理功能。酶的失活則是指酶的自身活性受損（包括輔酶、金屬離子受損），失去了與底物結合的能力。α－淀粉酶與β－淀粉酶二者的區別在于α－淀粉酶是一種內酶，可以跨越淀粉分子的α－1，6鍵到分子內部進行隨機切割，所得的產物為α型的麥芽糖和環糊精，它使碘色消失的速度較快，但還原糖較慢；β－淀粉酶則是一種外酶，不能跨越α－1，6鍵，只能從淀粉的非還原末端2個2個地進行切割，所得的產物為β型的麥芽糖和界限糊精，它使碘色消失較慢，但還原糖較快，二者的共同點在于都能水解α－1，4鍵和都不能水解α－1，6鍵。1.酶工程：又叫酶技術，是酶制劑的大規模生產和應用的技術。2.自殺性底物：底物經過酶的催化后其潛在的反應基團暴露，再作用于酶而成為酶的不可逆抑制劑，這種底物叫自殺性底物。3.別構酶；調節物與酶分子的調節中心結合后，引起酶分子的構象發生變化，從而改變催化中心對底物的親和力，這種影響被稱為別構效應，具有別構效應的酶叫別構酶4.誘導酶：有些酶在通常的情況下不合成或很少合成，當加入誘導物后就會大量合成，這樣的酶叫誘導酶Mol催化活性：表示在單位時間內，酶分子中每個活性中心轉換的分子數目6.離子交換層析：利用離子交換劑作為載體這些載體在一定條件下帶有一定的電荷，當帶相反電荷的分子通過時，由于靜電引力就會被載體吸附，這種分離方法叫離子交換層析。7.固定化酶：通過物理的或化學的方法，將酶束縛于水不溶的載體上，或將酶束縛于一定的空間內，限制酶分子的自由流動，但能使酶發揮催化作用的酶8.修飾酶：在體外用一定的化學方法將酶和一些試劑進行共價連接后而形成的酶1抗體酶：是一種具有催化作用的免疫球蛋白，屬于化學人工酶2酶反應器：是利用生物化學原理使酶完成催化作用的裝置，他為酶促反應提供合適的場所和最佳的反應條件，使底物最大限度的轉化為物。3模擬酶：利用有機化學合成的方法合成的比酶結構簡單的具有催化作用的非蛋白質分子叫模擬酶。4底物抑制：在酶促反應中，高底物濃度使反應速度降低的現象。5穩定pH：酶在一定的pH范圍之內是穩定的，超過這個限度易變性失活，這樣的pH范圍為此酶的穩定pH6產酶動力學：主要研究細胞產酶速率及各種因素對產酶速率的影響，包括宏觀產酶動力學和微觀產酶動力學。7凝膠過濾：又叫分子排阻層析，分子篩層析，在層析柱中填充分子篩，加入待純化樣品再用適當緩沖液淋洗，樣品中的分子經過一定距離的層析柱后，按分子大小先后順序流出的，彼此分開的層析方法。9非水酶學：通常酶發揮催化作用都是在水相中進行的，研究酶在有機相中的催化機理的學科即為非水酶學10液體發酵法：以液體培養基發酵為原料進行微生物的繁殖和產酶的方法，根據通風方法不同又分為液體表層發酵法和液體深層法。1.標志酶：通常可以將只分布于細胞內某個特定組分的酶稱為標志酶，可以將它作為細胞組分鑒別的依據，甚至可以判別組織或器官是否發生病變。2.寡聚酶：由兩個或兩個以上的亞基組成的酶，分子量一般高于30kDa，具有四級結構。構成寡聚酶的亞基可以相同，也可以不同，亞基之間一般以非共價鍵排列。3.多酶復合體：多酶復合體由兩個或兩個以上的酶靠非共價鍵連接而成4.液體深層發酵：也稱浸沒式培養，它利用液體培養基，在發酵罐內進行的一種攪拌通氣培養方式，發酵過程需要一定的設備和技術條件，動力消耗也較大，但是原料的利用率和酶的產量都較高，培養條件容易控制。5.共價催化：又稱親核或親電子催化，在催化時，親核催化劑或親電子催化劑分別放出電子或吸取電子并作用于底物的缺電子中心或負電子中心，迅速形成不穩定的共價配合物，降低反應的活化能，以達到加速反應的目的。8.酶分子修飾：通過各種方法可使酶分子結構發生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程稱為酶分子修飾。9.活性酯法：它主要由白蛋白琥珀酰化、活性脂形成和修飾等三個反應組成。10.親和標記：對酶的活性部位、受體的結合位點進行特異標記的方法。11.酶分子定向進化：是從一個或多個已經存在的親本酶出發經過基因的突變和重組，構建一個人工突變酶庫，通過篩選最終獲得預先期望的具體某些特征的進化酶。12易錯PCR：是在采用Taq酶進行PCR擴增目的基因時，通過調整反應條件，改變Taq酶的突變頻率，從而向目的基因中以一定的頻率隨機引入突變，構建突變庫，然后選擇或篩選需要的突變體。13脫氧核酶：脫氧核酶都是單鏈DNA分子通過自身卷曲、折疊形成的三維結構，在某些特殊的輔助因子的作用下與底物結合并發揮催化功能。14.抗體酶：具有催化能力的單克隆抗體，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結合的產物。15.拷貝法：是首先將已知酶作為抗原免疫動物，獲得抗酶的抗體，再以該抗酶的抗體免疫動物進行單克隆化，以獲得單克隆的抗體，用合適的方法對抗體進行篩選，就可得到具有已知酶活性的抗體酶。17.肽酶：就是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。18.半合成酶：是以天然蛋白或酶為母體，用化學或生物學方法引進適當的活性部位或催化基團，或改變其結構從而形成一種新的“人工酶”。19.分子印跡酶：通過分子印跡技術可以產生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產生有效的結合作用，同時在結合部位的空腔內誘導產生催化基團，并與底物定向排列，制備出人工模擬酶。21.pH記憶：將酶分子從水溶液轉移到有機溶劑中，酶能保持原有的離子化狀態，此時的環境因素也不能改變酶分子的這種狀態，或者說酶在緩沖液中所處的pH狀態仍被保持在有機溶劑中的這種現象。22.必需水：在有機介質中，酶分子需要一層水化層以維持其完整的空間構象，一般將維持酶分子完整空間構象所必須的最低水含量稱為必需水。23.水活度：是指在反應體系中水的逸度與純水逸度之間的比值。24.糖化酶：即葡萄糖淀粉酶，系統名為α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶，大量用作淀粉糖化劑。25.青霉素酰化酶；又稱青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶，由一個分子質量為20~23kDa、含有側鏈結合位點的亞基和一個分子質量為65~69kDa、含有催化位點的亞基組成，是半合成抗生素生產過程中有重要作用的一種酶。27.酶傳感器：是間接型傳感器，它不是直接測定待測物質的濃度，而是利用酶的催化作用，在常溫常壓下將糖類、醇類、有機酸、氨基酸等生物分子氧化或分解，然后通過測定與反應有關的物質濃度，進而推出相應的生物物質濃度。28：酶標免疫分析：是以待測抗原（或抗體）和酶標抗體（或抗原）的專一結合反應為基礎，通過酶活力測定來確定抗原(或抗體)含量的一類分析方法，可以分為酶聯免疫分析和酶多型免疫分析。29.靶酶：在生物體內新陳代謝過程中進行的多種化學反應幾乎都是在酶的催化下，以一定的速度、按確定的方向進行的。其中的每一種酶都有一些特定的抑制劑，通常將這種酶稱為該抑制劑的靶酶。30.酶標藥物：根據藥物在生物體內可能的作用目標，如酶或受體，來設計藥物，通常將由此獲得的藥物稱為酶標藥物。酶生物合成的調節：通過調節酶合成的量來控制微生物代謝速度的調節機制，轉錄水平的調節對酶的生物合成是最重要的調節。判斷題酶是具有生物催化特性的特殊蛋白質。（╳）酶的分類與命名的基礎是酶的專一性。（√）酶活力指在一定條件下酶所催化的反應速度，反應速度越大，意味著酶活力越高。（√）液體深層發酵是目前酶發酵生產的主要方式。（√）培養基中的碳源，其唯一作用是能夠向細胞提供碳素化合物的營養物質。（╳）膜分離過程中，膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質顆粒成分或分子通過，而把大于其孔徑的顆粒截留。（√）在酶與底物、酶與競爭性抑制劑、酶與輔酶之間都是互配的分子對，在酶的親和層析分離中，可把分子對中的任何一方作為固定相。（√）角叉菜膠也是一種凝膠，在酶工程中常用于凝膠層析分離純化酶。（╳）α－淀粉酶在一定條件下可使淀粉液化，但不稱為糊精化酶。（╳）酶法產生飴糖使用α－淀粉酶和葡萄糖異構酶協同作用。（╳）填空題日本稱為“酵素”的東西，中文稱為酶,英文則為Enzyme,是庫尼（Kuhne）于1878年首先使用的。其實它存在于生物體的細胞內與細胞外。1926年，薩姆納（Sumner）首先制得脲酶結晶，并指出酶的本質是蛋白質。他因這一杰出貢獻，獲1947年度諾貝爾化學獎。目前我國廣泛使用的高產糖比酶優良菌株菌號為As3.4309,高產液化酶優良菌株菌號為BF7.658。在微生物分類上，前者屬于霉菌，后者屬于細菌。1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操縱子學說，認為DNA分子中，與酶生物合成有關的基因有四種，即操縱基因、調節基因、啟動基因和結構基因。1961年，國際酶委會規定的酶活力單位為：在特定的條件下（25oC，PH及底物濃度為最適宜）每1分鐘內,催化1μmol的底物轉化為產物的酶量為一個國際單位，即1IU。酶分子修飾的主要目的是改進酶的性能，即提高酶的活力、減少抗原性，增加穩定性。酶的生產方法有提取法，發酵法和化學合成法。借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，制成網狀結構的固定化酶的方法稱為交聯法。酶的分離純化方法中，根據目的酶與雜質分子大小差別有凝膠過濾法，超濾法和超離心法三種。由于各種分子形成結晶條件的不同，也由于變性的蛋白質和酶不能形成結晶，因此酶結晶既是純化手段，也是純化標志。1.決定酶催化活性的因素有兩個方面，一是酶分子結構，二是反應條件。2.求Km最常用的方法是雙倒數作圖法。3.多底物酶促反應的動力學機制可分為兩大類，一類是序列機制，另一類是乒乓機制。4.可逆抑制作用可分為競爭性反競爭性非競爭性混合性5.對生產酶的菌種來說，我們必須要考慮的條件有，一是看它是不是致病菌，二是能夠利用廉價原料，發酵周期短，產酶量高，三是菌種不易退化，四是最好選用能產生胞外酶的菌種，有利于酶的分離純化，回收率高。6.酶活力的測定方法可用終止反應法和連續反應法。7.酶制劑有四種類型即液體酶制劑，固體酶制劑，固定化酶制劑和純酶制劑。8.通常酶的固定化方法有吸附法共價鍵結合法交聯法包埋法9.酶分子的體外改造包括酶的表面修飾和內部修飾。10.模擬酶的兩種類型是半合成酶和全合成酶。11.抗體酶的制備方法有引物法和拷貝法。1.Km值增加，其抑制劑屬于競爭性抑制劑，Km不變，其抑制劑屬于非競爭性抑制劑，Km減小，其抑制劑屬于反競爭性抑制劑。2.菌種培養一般采用的方法有液體培養法和固體培養法。3.菌種的優劣是影響產酶發酵的主要因素，除此之外發酵條件對菌種產酶也有很大的影響，發酵條件一般包括溫度，pH，濕度，通氣量，和泡沫攪拌等。4.打破酶合成調節機制限制的方有控制條件，遺傳控制，其他方法。5.酶生物合成的模式分是同步合成型延續合成型中期合成型滯后合成型6.根據酶和蛋白質在穩定性上的差異而建立的純化方法有熱變性法，酸堿變性法和表面變性法7.通常酶的固定化方法有包埋法，共價鍵結合法，吸附法，交聯法。8.酶分子的體外改造包括酶的表面修飾和內部修飾。9.酶與抗體的重要區別在于酶能夠結合并穩定化學反應的過渡態，從而降低了底物分子的能障，而抗體結合的抗原只是一個基態分子，所以沒有催化能力問答題（了解）如何檢查一種酶的制劑是否達到了純的制劑？試用所學過的知識加以論述。要檢測酶的制劑是否達到純的制劑（即不含雜質及雜質酶），可以有以下幾種方法：層析法：包括紙層析、凝膠層析、柱層析及親和層析電泳法：包括SDS凝膠電泳法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法超離心法：不同的酶分子大小不同，在重力場中具有不同的沉降系數，從而可以通過超離心方法分離目的酶與雜質酶。免疫反應法：由于酶分子可作為一種抗原物質，而抗原與抗體之間具有專一的親和力，故可選用目的酶的抗體與酶制劑進行免疫擴散或免疫電泳，從而判斷酶的制劑是否純凈。氨基酸序列分析法：采用特定的化學物質從酶的N末端將氨基酸殘基逐個水解下來，最終可獲知該酶的氨基酸序列，從而也可以判斷出酶制劑是否純凈。層析法：包括紙層析、凝膠層析、柱層析及親和層析電泳法：包括SDS凝膠電泳法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法超離心法：不同的酶分子大小不同，在重力場中具有不同的沉降系數，從而可以通過超離心方法分離目的酶與雜質酶。免疫反應法：由于酶分子可作為一種抗原物質，而抗原與抗體之間具有專一的親和力，故可選用目的酶的抗體與酶制劑進行免疫擴散或免疫電泳，從而判斷酶的制劑是否純凈。氨基酸序列分析法：采用特定的化學物質從酶的N末端將氨基酸殘基逐個水解下來，最終可獲知該酶的氨基酸序列，從而也可以判斷出酶制劑是否純凈。今欲生產糖化酶結晶產品，試擬出合理的工藝步驟，并說明下游工程的主要工藝條件。生產糖化酶的結晶產品，可采用鹽析結晶法。得到糖化酶粗酶液后，須進行分離純化，使其達到一定的濃度和純度（﹥50％），向濃酶液中緩慢加入飽和中性鹽溶液（（NH4）2SO4），至出現稍渾濁，于低溫下（0－4oC）靜置，待溶液中有晶體析出，可向溶液中補充少量飽和鹽溶液。（操作過程中保證PH≈4.5），也可采用有機溶劑法結晶。向濃酶液中緩慢加入有機溶劑，混合均勻，于低溫下靜置一段時間，離心去除沉淀物，取上清液靜置于低溫下，可析出晶體。發酵生產糖化酶工藝流程：斜面菌種小米三角瓶孢子懸浮液種子罐發酵罐糖化酶粗酶液固定化細胞發酵有哪些優點？細胞流失少，使用壽命長，提高設備利用率細胞密度大，產量大由于載體的保護，細胞的耐受性增強便于條件控制，簡化操作，易于自動化生產催化產物少了細胞的干擾，易于分離提純由于使用周期延長，使成本降低。固定化酶和游離酶相比，有何優缺點？優點（1）易將固定化酶和底物，產物分開產物溶液中沒有酶的殘留簡化了提純工藝（2）可以在較長的時間內連續使用（3）反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化（4）提高了酶的穩定性（5）較能適于多酶反應（6）酶的使用效率高產率高成本低缺點固定化時酶的活力有損失比較適應于水溶性底物與完整的細胞相比，不適于多酶反應。（每點一分，答滿滿分）寫出三種分離純化酶蛋白的方法，并簡述其原理。透析與超慮離心分離凝膠過濾鹽析等電點沉淀共沉淀吸附層析電泳親和層析熱變性酸堿變性表面變性等（寫出一種方法1分）每種方法的原理敘述總計7分為什么酶制劑的生產主要以微生物為材料？（1）微生物種類多，酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣（2）微生物生長繁殖快，酶易提取，特別是胞外酶（3）來源廣泛，價格便宜微生物易得，生長周期短可以利用微電腦技術控制酶的發酵生產，可進行連續化，自動化，經濟效益高可以利用以基因工程為主的分子生物學技術，選育和改造菌種，增加產酶率和開發新酶種下面是某人對酶測定的一些數據，據此求出該酶的最大反應速度和米氏常數。[S](mol/L)V0(umol/min)0.510-6284.010-6401.010-5702.010-5954.010-51121.010-41282.010-41391.010-2140.最大反應速度140Km:1.010-51在生產實踐中，對產酶菌有何要求？答：一般必須符合下列條件不應當是致病菌，在系統發育上最好是與病原菌無關能夠利用廉價原料，發酵周期短，產酶量高菌種不易變異退化，不易感染噬菌體最好選用產胞外酶的菌種，有利于酶的分離純化，回收率高在食品和醫藥工業上應用，安全問題更顯得重要。對酶進行化學修飾時，應考慮哪些因素？（1）被修飾酶的性質，包括酶的穩定性，酶活性中心的狀況，側鏈基團的性質及反應性（2）修飾反應的條件，包括PH與離子強度，修飾反應時間和溫度，反應體系中酶與修飾劑的比例等列出用共價結合法對酶進行固定化時酶蛋白上可和載體結合的功能團（1）酶蛋白N端的α氨基或賴氨酸的∑氨基2分（2）酶蛋白C端的羧基及天冬氨酸的β羧基或谷氨酸的γ羧基2分（3）半胱氨酸的巰基1分絲氨酸駱氨酸蘇氨酸上的羥基2分苯丙氨酸和駱氨酸上的苯環1分組氨酸上的咪唑基1分色氨酸上的吲哚基1分某酶的初提取液經過一次純化后，經測定得到下列數據，試計算比活力，回收率及純化倍數。體積（ml）活力單位（u/ml）蛋白氮（mg/ml）初提取液1202002.5硫酸銨沉淀58101.5（1）起始總活力：200120＝24000（單位）1分（2）起始比活力：2002.5＝80（單位/毫克蛋白氮）1分（3）純化后總活力8105＝4050（單位）2（4）純化后比活力8101.5＝540（單位/毫克蛋白氮）2分（5）產率（百分產量）：405024000＝17％2分（6）純化倍數：54080=6.752分1.酶工程主要涉及哪些方面的研究和運用。酶工程主要指天然酶制劑在工業上的大規模應用，由4個部分組成：①酶的產生；②酶的分離純化；③酶的固定化；④生物反應器。酶工程的應用范圍:（1）對生物寶庫中存在天然酶的開發和生產；（2）自然酶的分離純化及鑒定技術；（3）酶的固定化技術（酶和細胞固定化）；（4）酶反應器的研制和應用；（5）與其他生物技術領域的交叉和滲透。其中固定化酶技術是酶工程的核心。實際上有了酶的固定化技術，酶在工業生產中的利用價值才真正得以體現。2.應用微生物來開發酶有哪些優點。①微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣②微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶③微生物培養基來源廣泛、價格便宜④可以采用微電腦等新技術，控制酶發酵生產過程，生產可連續化、自動化，經濟效益高⑤可以利用以基因工程為主的近代分子生物學技術，選育菌種、增加酶產率和開發新酶種3.什么是專一性不可逆抑制，試舉例說明。專一性不可逆抑制：不可逆性抑制作用的抑制劑，通常以共價鍵方式與酶的必需基團進行不可逆結合而使酶喪失活性。如有機磷殺蟲劑抑制昆蟲的乙酰膽堿酯酶就是這種方式。有機磷殺蟲劑能專一作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。當膽堿酯酶被有機磷殺蟲劑抑制后，乙酰膽堿不能及時分解成乙酸和膽堿，引起乙酰膽堿的積累，使一些以乙酰膽堿為傳導介質的神經系統處于過度興奮狀態，引起神經中毒癥狀。4.聯系實驗教學舉例說明菌種分離的一般過程。菌種分離的一般過程：土樣的采取，預處理，培養，菌落的選擇，產品的鑒定。5.酶發酵生產的菌株一般需具備什么條件。①不是致病菌，在系統發育上最好是與病原體無關②能夠利用廉價原料，發酵周期短，產酶量高③菌種不易變異退化，不易感染噬菌體④最好選用產生胞外菌的菌種，有利于酶的分離，回收率高6.產酶微生物誘變育種步驟的主要方法和步驟主要方法：物理、化學或生物誘變方法誘變育種步驟：出發菌株的選擇、處理菌懸液的制備、誘變處理、中間培養、分離和篩選7.簡要說明微生物產酶（生產）的主要發酵方式（1）固體發酵法：利用麩皮和米糠為主要原料，添加谷殼，豆餅等，加水拌成半固體狀態，供微生物生長和產酶用。分為淺盤法、轉桶法、厚層通氣法等（2）液體發酵：以液體為培養基，進行微生物的生產繁殖和產酶。分為液體表層發酵法和液體深層發酵法（3）固定化細胞發酵優點：①固定化細胞的密度大，反應器生產強度大；②發酵穩定性好，可以連續使用較長時間，易于連續化，自動化生產；③可在高稀釋率的條件下連續發酵（D＞μm）,提高設備利用率；④發酵液含菌體較少，利于產品分離。8.哪些因素影響微生物發酵產酶？如何提高微生物產酶量?培養基營養物質：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、產酶促進劑、微量元素以及發酵條件：pH值、溫度、溶解氧、泡沫、濕度均影響微生物發酵產酶。提高微生物產酶量的方法主要有：通過條件控制提高產酶量，如添加誘導物、降低阻遏物濃度；通過基因突變提高產酶量，如使誘導型轉變為組成型、使阻遏型轉變為去阻遏型；其他方法，如添加表面活性劑、使用其他產酶促進劑9.什么是組成型突變，什么是抗分解代謝物阻遏突變？組成型突變：與酶的合成有關的調節基因的一種突變。即原來酶的合成量受調節基因調節的誘導酶或阻遏酶，由于調節基因發生變異，酶的合成變為組成型（不管生長條件如何，酶的合成量總是恒定的）的一種現象。分解代謝物效應（阻遏）指細胞內同時有兩種分解底物存在時，利用快的那種底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。抗分解代謝物阻遏突變是指產生的突變解除了分解代謝物阻遏。11.什么是固定化酶，它們用于生產有哪些優點固定化酶：水溶性酶通過物理和化學的方法，使之與不溶性載體結合形成的一種不再溶解的酶。優點：①極易將固定化酶與底物、產物分開，產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；②可以再較長時間內反復使用，有利于工藝的連續化、管道化；③酶反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化和微電腦化；④在絕大多數情況下提高了酶的穩定性；⑤較能適應于多酶反應；⑥酶的使用效率提高，產物得率提高，產品品質有保障，成本低12.酶的固定化方法主要有哪些？作簡單闡述將酶用物理或化學的方法固定在不溶于水的載體上，形成一種可以重復使用的酶，叫固定化酶。制備固定化酶的方法很多，有包埋法，吸附法，共價鍵結合法，以及交聯法等1.包埋法：將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進劑作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化。操作簡單，可制得較高活力的固定化酶。2.吸附法：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面而使酶固定化的方法。常用的吸附劑有活性炭，氧化鋁，硅藻土，多孔陶瓷，多孔玻璃，硅膠，羧基磷灰石等.操作簡便，條件溫和，不會引起酶的變性失活，載體價廉易得，可反復使用。但酶與載體結合不太牢固易脫落3.共價鍵結合法：酶蛋白側鏈基團和載體表面上的功能基團之間形成共價鍵而固定的方法。酶與載體牢固，制得的固定化酶穩定性好。但制備過程中反應條件較為強烈，難以控制，易使酶變性失活，且制作手續繁瑣。4.交聯法：利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶與載體間、或酶與惰性蛋白間進行交聯反應以制得固定化酶的方法。常用的試劑有戊二醛，己二胺，順丁烯二酸酐，雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。制備的固定化酶結合牢固，可長時使用.但由于交聯反應較激烈，酶分子的多個基團被交聯，酶活力損失較大

13.結合實驗闡述一種固定化菌體的方法和步驟。以酵母細胞的固定化為例，本實驗固定化的方法是把細胞懸浮在海藻酸鈉溶液中，滴進氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈣凝膠小球。細胞包埋在凝膠的小孔中，制成固定化細胞。通過包埋法，對酵母活細胞進行固定。并對麥芽汁進行發酵實驗。操作步驟①調取活化培養24h的酵母斜面菌種一環，接種于10ml麥芽汁試管中，25℃搖瓶培養48h。②取酵母菌體懸浮液10mL，懸浮在10mL4%海藻酸鈉溶液（冷卻到約50度不太燙手）中混合均勻。③用滅過菌的注射器吸取上述懸浮液，逐滴滴入到50mL氯化鈣溶液中，浸泡30~120min使之形成凝膠珠。④待凝膠珠在溶液中泡30min后，濾出凝膠珠得到固定化細胞。轉到200ml三角瓶中，用無菌水洗滌3次，膠珠轉入用75%乙醇消毒過的可樂瓶中

注入約2/3體積的無菌麥芽汁，密閉在25℃下發酵7-9天，注意適當放氣勿使其爆炸。14.什么是酶的分子修飾，修飾的目的有哪些？各種方法使酶分子的結構發生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團（物質），特別是具有生物相容性的物質，進行共價連接，從而改變酶的結構和性質。意義：①提高酶的活力②增強酶的穩定性③降低或消除酶的抗原性④研究和了解酶分子中主鏈、側鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象的影響15.什么是酶的體外定向進化，什么是DNA改組（DNAshuffling）所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白質的非合理設計，它不需事先了解酶的空間結構和催化機制，通過人為地創造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質的突變酶。DNA改組（DNAshuffling）又稱有性PCRDNA或DNA重排，是運用隨機突變技術，對某種感興趣的蛋門質或核酸進行快速的改造，并定向選擇所需性質的生物分子的方法。16.酶的非水相催化有何優點，它們的主要類型有哪些？優點：①提高脂溶性底物的溶解度，有利于高濃度底物連續生物轉化②水解酶能催化合成反應，如脂的合成和肽的合成.③可以控制由水引起的副反應④酶不溶于有機介質，易于回收再利用⑤酶的固定化簡單，可以只沉積在載體表面⑥從低沸點的溶劑中分離純化產物比水中容易⑦酶的熱穩定比水高，而且沒有微生物污染類型：⑴有機介質中的酶催化：有機介質中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進行的催化反應。適用于底物、產物兩者或其中之一為疏水性物質的酶催化作用。⑵氣相介質中的酶催化：酶在氣相介質中進行的催化反應。適用于底物是氣體或者能夠轉化為氣體的物質的酶催化反應。⑶超臨界介質中的酶催化：酶在超臨界流體中進行的催化反應。超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質超臨界點的流體。⑷離子液介質中的酶催化：酶在離子液中進行的催化作用。離子液是由有機陽離子與有機（無機）陰離子構成的在室溫條件下呈液態的低熔點鹽類，揮發性低、穩定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩定性和區域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點。17.水在酶的非水相催化中有什么作用？水的作用：⑴必需水與低水系統。嚴格的說，酶在絕對無水的條件下，是不可能具有催化活力的。酶的催化功能與它的空間結構緊密相關，破壞其空間構象，酶便失去其催化功能。維持酶蛋白空間構象的主要作用力是氫鍵，疏水作用和范德華力。在水溶液中，水分子直接或間接地通過這些化學鍵來維持酶分子催化活力所必需的構象，而且水在酶的穩定性及動力學性態的決定上起著重要的作用。含水量與酶的穩定性有關。酶在脫水條件下異常穩定。⑵必需水對酶活性影響，不是所有水溶液中的水分子都與酶催化活性有關。實際上只有必需水才重要。在水合過程中酶蛋白結構沒有明顯的變化。必須水量也決定于有機溶劑。18.按結構區分常見的酶反應器類型有哪些？簡述它們的特點。用于酶進行催化反應的容器及其附屬設備稱為酶反應器。按結構區分：⑴

拌罐式反應器：反應比較完全，反應條件容易調節控制。⑵鼓泡式反應器：鼓泡式反應器的結構簡單，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質、傳熱效率高，適合于有氣體參與的反應。⑶填充床式反應器：密度大，可以提高酶催化反應的速度。在工業生產中普遍使用。⑷流化床式反應器：流化床反應器具有混合均勻，傳質和傳熱效果好，溫度和pH值的調節控比較容易，不易堵塞，對粘度較大反應液也可進行催化反應。⑸膜反應器：清洗比較困難酶生物合成法生產的主要工藝過程包括那幾個步驟？(1)用作培養菌種及擴大生產的發酵罐的培養基的配制(2)培養基、發酵罐以及輔助設備的消毒滅菌(3)將已培養好的有活性的純菌株以一定量轉接到發酵罐中(4)接種到發酵罐中的菌株控制在最適條件下生長并形成代謝產物(5)將產物抽提并進行精制(6)回收或處理發酵過程中產生的廢物和廢水如何控制微生物發酵產酶的工藝條件？發酵過程中，為了能對生產過程進行必要的控制，需要對有關工藝參數進行定期取樣測定或進行連續測量。參數中，對發酵過程影響較大的有溫度、ＰＨ、溶解氧濃度等。(1)溫度:溫度對發酵的影響是多方面的，主要表現在對細胞生長、產物形成、發酵液的物理性質和生物合成方面。例如：枯草桿菌的最適溫度為34--37℃，黑曲霉的最適溫度為28--32℃(2)pH:發酵過程中pH的變化取決于所用的菌種、培養基的成分和培養條件。微生物生長和生物合成都有其最適和能夠耐受的pH范圍，大多數微生物生長的最適pH6.3-7.5，霉菌和酵母生長的最適pH4-6，放線菌生長的最適pH7-8。(3)溶解氧濃度:對于好氧發酵，溶解氧濃度是最重要的參數之一。好氧性微生物深層培養時，需要適量的溶解氧以維持其呼吸代謝和某些產物的合成，氧的不足會造成代謝異常，產量降低。簡述凝膠層析、親和層析、離子交換層析的原理和操作要點？離子交換層析原理：根據待分離物質帶電性質不同的分離純化方法。操作:a上樣：上樣體積不十分嚴格。b洗脫:增加溶液的離子強度c梯度洗脫法:改變溶液的pHd再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl處理。凝膠層析原理：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。大分子物質不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；小分子物質可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。操作：a凝膠的選擇和處理,根據相對分子質量范圍選擇相應型號的凝膠介質。將干膠懸浮于5-10倍的蒸餾水中，充分溶脹，抽氣，裝柱。b柱的選擇:采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。c加樣:體積不能過多，不超過凝膠床體積的5％，脫鹽時可在10％左右。d洗脫:洗脫液與平衡時用的buffer一致。洗速不可過快，保持恒速。e膠的保存:洗脫完畢后，凝膠柱已恢復到上柱前的狀態，不必再生處理。親和層析原理:利用生物大分子間特異的親和力來純化生物大分子.體通過適當的化學反應共價的連接到載體上，待純化的物質可被配體吸附，雜質則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，即可將分離的物質洗脫下來，實現分離提純。簡述凝膠電泳的分類及其原理？瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。分辨率較高。簡述酶結晶的主要方法和原理？（1）鹽析結晶法：在適當的溫度和ＰＨ值等條件下，于接近飽和的酶液中緩慢增加某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度緩慢降低，達到稍微過飽和狀態，而析出酶晶體的過程（２）有機溶劑結晶法：在接近飽和的酶液中緩慢增加某種有機溶劑，使酶的溶解度緩慢降低，而析出酶晶體的過程（３）透析平衡結晶法：將酶液裝進透析袋，對一定濃度的鹽溶液進行透析，使酶液逐步達到過飽和狀態而析出結晶的過程。前提：酶液要達到一定純度（經過純化）酶液要濃縮到一定濃度（４）等電點結晶法：通緩慢加入濃酶液的ＰＨ值、使之逐漸達到酶的等電點，而析出酶晶體的過程定點突變技術在酶分子修飾中有何應用？定義：指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術。是蛋白質工程和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術。應用：新的酶分子結構的設計；突變基因堿基序列的確定；突變基因的獲得；新酶的獲得。何謂固定化酶？經過固定化以后，酶的特性有哪些改變？固定化酶：固定在載體上，并在一定空間范圍內進行催化反應的酶稱為固定化酶。改變有：穩定性：固相酶的穩定性比游離酶高，主要表現在：（1）熱穩定性：固定化酶熱穩定性較之天然酶提高。（2）對蛋白酶水解作用穩定性：固相酶比天然酶有更強的抵抗蛋白酶水解作用的能力。（3）對變性試劑作用的穩定性：固相酶對各種蛋白變性劑的穩定性，一般都比天然酶強。（4）保藏穩定性：固相酶比天然酶保存的時間更長。最適溫度：(1)固相酶的最適溫度一般比天然酶高，個別會有所降低(2)同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同最適pH：酶經固定化后，其作用的最適pH常會發生偏移影響固定化酶最適PH的因素主要有兩個。(1)載體性質對最適pH影響：用帶負電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH高。用帶正電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH低。用不帶電荷載體制備的固定化酶，最適pH一般不改變。(2)產物性質對最適pH影響；若酶催化反應產物為酸性時，固定化酶最適pH比游離酶的最適pH要高。若酶催化反應產物為堿性時，固定化酶最適pH比游離酶的最適PH要低。若酶催化反應產物為中性時，固定化酶最適pH不變。底物特異性：固定化酶底物特異性與游離酶相比，有一定變化，一般為：作用于小分子底物的酶類經固定化后，專一性基本不變。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶類經固定化后專一性會發生變化。舉例說明固定化酶在工業上的應用？現已用于工業化生產的固定化酶主要有：(1)氨基酰化酶：這是世界上第一種工業化生產的固定化酶。降低生產成本(2)葡萄糖異構酶：這是世界上生產規模最大的一種固定化酶。常用于連續生產果葡糖漿(3)天門冬氨酸酶：用于工業生產。將延胡索酸轉化生產Ｌ－天冬氨酸（4)青霉素酰化酶：這是在醫藥工業上廣泛應用的一種固定化酶。用于制造各種生產半合成青霉素和頭孢菌素什么是固定化細胞？固定化細胞有何應用？定義：固定在載體上，并在一定空間范圍內進行生命活動的細胞，稱為固定化細胞。固定化細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，故又稱為固定化活細胞或固定化增殖細胞。應用：1、利用固定化微生物細胞生產各種能夠分泌到細胞外的產物：(1)酒精酒類：(2)氨基酸：(3)有機酸：(4)酶和輔酶(5)抗生素(6）固定化微生物細胞還可以用于甾體轉化及有機溶劑、維生素、化工產品等的生產。固定化微生物細胞制造微生物傳感器：分為呼吸活性測定型和電極活性測定性兩種固定化植物細胞的應用。（1）制造人工種子（2）用于生產各種色素、香精、藥物、酶等次級代謝物。3、固定化動物細胞的應用：主要應用于生產小兒麻痹癥疫苗、狂犬病疫苗等酶反應器的設計主要包括哪些內容？1、確定酶反應器的類型。酶反應器的設計，首先要根據酶、底物和產物的性質，按照上一節所述的選擇原則，選擇并確定反應器的類型。2、確定反應器的制造材料。由于酶催化反應具有條件溫和的特點，通常都是在常溫、常壓、pH近乎中性的環境中進行反應，所以酶反應器的設計對制造材料沒有什么特別要求，一般采用不銹鋼制造反應容器即可。3、進行熱量衡算。酶催化反應一般在30～70℃的常溫條件下進行，所以熱量衡算并不復雜。溫度的調節控制也較為簡單，通常采用一定溫度的熱水通過夾套（或列管）加熱或冷卻方式，進行溫度的調節控制，熱量衡算是根據熱水的溫度和使用量計算。對于某些耐高溫的酶，例如高溫淀粉酶，可以采用噴射式反應器，熱量衡算時，根據所使用的水蒸氣熱焓和用量進行計算。4、進行物料衡算。酶反應動力學參數/底物用量/酶量/反應體積/反應器數量在酶反應器的應用過程中要注意哪些問題？酶的穩定性對酶反應器的功效是很重要的。在操作過程中，有時需要用酸或堿來調節反應液PH。如果局部的pH過高或過低，就會引起酶的失活，或者使底物和產物發生水解反應。這時，可用加快攪拌已促使混合均勻。如果底物和產物在反應器中不夠穩定的話，可以采用高濃度的酶，以減少底物和產物在反應器中的停留時間，從而減少損失。防止微生物污染酶的分類與命名：P酶：主要由蛋白質組成的酶；R酶：主要有核糖核酸組成的酶。酶的分類：根據酶的化學組成可將酶分為：1.單純蛋白酶類：只含有蛋白質成分；2.結合蛋白酶類（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（輔助因子）全酶=酶蛋白+輔助因子根據酶蛋白結構特點可將酶分為單體酶：以一個獨立的三級結構為完整生物功能分子的最高結構形式的酶。寡聚酶：以一個獨立的四級結構為完整生物功能分子的最高結構形式的酶。多酶復合體：由多種酶彼此鑲嵌成一個功能完整的具有特定結構的復合體,它們相互配合依次進行，催化連續的一系列相關反應。酶合成調節的類型誘導:組成酶：細胞固有的酶類。誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似物而臨時合成的一類酶。阻遏:分解代謝物阻遏和反饋阻遏酶合成的調節機制：1.酶合成的誘導：加進某種物質，使酶生物合成開始或加速進行。2.末端產物阻遏：由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏。3.分解代謝物阻遏：指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。提高酶產量的措施：1.添加誘導物：①酶的作用底物：如青霉素是青霉素酰化酶的誘導物。②酶的反應產物：如纖維素二糖可誘導纖維素酶的產生。③酶的底物類似物：如異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）對β-半乳糖苷酶的誘導效果比乳糖高幾百倍2.降低阻遏物濃度：微生物酶的生產受到代謝末端產物的阻遏和分解代謝物阻遏的調節。為避免分解代謝物的阻遏作用，可采用難于利用的碳源，如在β-半乳糖苷酶的生產中，只有在培養基中不含葡萄糖時，才能大量誘導產酶。3.添加表面活性劑（產酶促進劑）：改變細胞的通透性或對酶分子有一定的穩定作用如在霉菌的發酵生產中添加1%的吐溫可使纖維素酶的產量提高幾倍到幾十倍。

酶發酵動力學：主要研究發酵過程中細胞生長速度，產物生成速度，基質消耗速度以及環境因素對這些速度的影響等。產酶動力學：主要研究細胞產酶速度以及各種環境對產酶速度的影響規律。分為宏觀酶動力學和微觀酶動力學一般產酶動力學方程可表達為：。式中X——細胞濃度(g/L)；m——細胞比生長速率(h-1)；a——生長偶聯的比產酶系數(IU/g)；t——時間(h)；E——酶濃度(IU/L)；b——非生長偶聯的比產酶速率(IU/(g×h))；生長偶聯型；部分生長偶聯型；非生長偶聯型細胞破碎：對于不同的生物體、或同一生物體的不同組織的細胞，由于細胞外層結構不同，所采用的細胞破碎方法和條件也有所不同，必須根據具體情況進行選擇。細胞破碎確認：1.直接測定破碎前后的細胞數：破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數器直接計數；破碎后，用染色法區分破碎細胞與完整細胞。2.測定導電率：利用破碎前后導電率的變化測定破碎程度。3.測定釋放的蛋白質量或酶活力：測定破碎液中胞內蛋白質或目的酶的釋放量，估算破碎率。鹽析沉淀法（改變離子強度）：向蛋白質或酶的水溶液中加入中性鹽，可產生兩種現象：①鹽溶：低濃度的中性鹽增加蛋白質的溶解度。②鹽析：高濃度的中性鹽降低蛋白質的溶解度。蛋白質的鹽析：原因：高鹽濃度下鹽離子與蛋白質分子爭奪水分子，降低溶解度而沉淀。不同蛋白質分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質先后析出，稱分段鹽析。鹽析的影響因素：①離子強度和種類（介紹鹽析常數）②蛋白質濃度：過稀回收沉淀困難，2.5%-3%最好。③pH值：等電點處最易沉淀。④溫度的影響：稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質溶解度提高。濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質溶解度下降。一般可在室溫下進行。某些對溫度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。等電點沉淀法：1）.原理：蛋白質在等電點時溶解度最低；不同的蛋白質具有不同的等電點2）.使用方法：單獨使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯合使用（如鹽析法、有機溶劑法），因蛋白質在等電點時仍有一定的溶解度。3）.優點：①大多數蛋白質的pH都在偏酸性范圍內②無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低③無需除掉多余酸即可進行下一步純化4）.缺點：酸化時，容易引起蛋白質失活有機溶劑沉淀（降低介電常數）：利用酶等蛋白質在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1).沉淀機理：降低溶液的介電常數；引起蛋白質脫水2).常用有機溶劑：丙酮>乙醇>甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。3).優缺點：優點：①分辨率比鹽析法高②沉淀不需脫鹽③溶劑易蒸發，沉淀易離心。缺點:①容易引起蛋白質變性失活②有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。4）.影響有機溶劑沉淀的因素①溫度：低溫（0℃）操作。②pH值：盡可能靠近其等電點。③離子強度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液，增加蛋白質在有機溶劑中的溶解度，目的：防止蛋白質變性④蛋白質濃度：適當，一般為5?20mg/ml有機聚合物沉淀法：1）.作用機理：與有機溶劑類似，是發展較快的一種新方法。2）.沉淀劑：常用聚乙二醇（簡寫PEG）多用分子量為6000～20000的PEG。3）.優點：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當多的生物大分子。③沉淀后有機聚合物容易去除。選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質變性沉淀而不影響所需蛋白質的方法。1）熱變性：幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。2）pH變性：通過改變pH或等電點沉淀法。3）有機溶劑變性：使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。肽鏈有限水解修飾1、概念：利用肽鏈有限水解，使酶的空間結構發生精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。2、修飾后酶性質的變化:（1）提高酶活力（水解后，主鏈的斷裂有利于酶活性中心的形成，使酶分子顯示其催化功能或是酶活力提高）（2）降低或無抗