第二十五章基因診斷和基因治療GeneDiagnosisandGeneTherapy第一節基因診斷GeneDiagnosis基因診斷的優勢：①可在源頭上識別基因正常與否，屬于“病因診斷”②針對特定基因，特異性強③所用的PCR等技術具有放大效應，故靈敏度高④適用性強，診斷范圍廣是指利用分子生物學技術和方法直接檢測基因結構及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。基因診斷的定義：、基因診斷的主要對象和樣品來源主要是DNA分子，涉及到功能分析時，還可定量檢測RNA（主要是mRNA）和蛋白質等分子。臨床上可用于基因診斷的樣品有血液、組織塊、羊水和絨毛、精液、毛發、唾液和尿液等。對象：樣品來源：二、基因診斷技術分類定性分析定量分析基因分型檢測基因突變測定基因拷貝數測定基因表達產物量基本流程：基因診斷的基礎核酸抽提目的序列擴增分子雜交信號檢測核酸分子雜交DNA序列分析幾種技術聯合使用（一）基因缺失或插入的診斷1．DNA印跡法可檢測樣品的基因型及或插入片段的大小

||

BgIIIBgIII5.2kb||BgIIIBgIII4.6kb

HomoHeteroNormal5.2kb4.6kbβ-地中海貧血：β-珠蛋白基因3'末端缺失0.6kb2．PCR法正常異常插入

正異標體內疾病相關基因缺失或突變病原微生物基因存在與否（二）點突變的基因診斷1．等位基因特異性寡核苷酸（ASO）分子雜交一對探針：針對已知突變，分別合成一對寡核苷酸探針，其中一個為野生型探針(與無突變序列互補)，另一個是突變型探針(與突變序列互補)，突變堿基及對應的正常堿基置于探針中央。2．反向點雜交是改進的ASO技術。一次檢測可以同時篩查多種突變，大大提高了基因診斷效率。3．變性高效液相色譜在PCR中，待測DNA單鏈產物可以隨機與互補鏈結合形成雙鏈，若存在點突變，則出現異源雙鏈DNA。在相同的部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區而更易變性，被色譜柱保留時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來（色譜圖表現為雙峰或多峰的洗脫曲線）。（reversedotblot，RDB）原理和結果判斷與PCR/ASO相同。不同：探針固定于膜上，PCR產物在液相中。（可檢測未知點突變）4．DNA序列分析用于基因突變類型已明確的遺傳病的診斷及產前診斷。——診斷基因突變最直接的方法左側正常對照第225位堿基為C，而患兒為APCR-限制性片段長度多態性分析

(PCR-RFLP)RFLP原理：用某種限制性內切酶消化人DNA產生許多不同長度的限制酶切片段當基因突變（點突變、缺失、插入等）酶切位點改變（消失、移動、新位點）限制性片斷數量和長度發生改變。PCR-RFLP：PCR擴增包含待測位點的DNA片段用識別該位點的限制性內切酶水解瓊脂糖電泳觀察結果。DNA多態性——在人群中，個體間基因組的核苷酸序列存在

差異性。TAGAGTACAG正常突變突變正常Marker（三）間接基因診斷──檢測致病基因的

連鎖遺傳標志原理：

同一染色體上位置相鄰的基因或其他遺傳標志通常一起遺傳，形成連鎖。通過對一個或幾個基因或遺傳標志的分析，可了解另外的基因。

人類基因組上的DNA遺傳標記：1980限制性片段長度多態性(RFLPs)1985短串聯重復序列(shorttendemrepeats,STRs)1990s單核苷酸多態性(SNPs)

某一RFLP存在于致病基因染色體上，正常基因無該RFLP；或RFLP不存在于致病基因染色體上，正常基因有該RFLP。致病基因RFLP正常基因PCR-RFLP連鎖分析P1P2正常雜合子純合子PCR-STR連鎖分析

人類基因的基因內或旁側存在許多重復序列(如微衛星DNA、小衛星DNA)，由于重復數目不同形成多態性。己發現一些基因結構和表達異常與這些重復序列有關。

主要形式為：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以(CA)n，(GT)n為多見。polymorphicsequencesPCRproducts三、基因診斷的醫學應用（一）遺傳性疾病診斷和風險預測基因診斷目前可用于遺傳篩查和產前診斷。疾病致病基因突變類型診斷方法α地中海貧血α珠蛋白缺失為主Gap-PCR、DNA雜交、DHPLCβ地中海貧血β珠蛋白點突變為主反向點雜交、DHPLC甲型血友病凝血因子Ⅷ點突變為主PCR-RFLP乙型血友病凝血因子Ⅸ點突變、缺失等PCR-STR連鎖分析苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶點突變PCR-STR連鎖分析、ASO分子雜交馬凡綜合癥原纖蛋白點突變、缺失PCR-VNTR連鎖分析、DHPLC我國部分代表性常見單基因遺傳病基因診斷（二）多基因常見病的預測性診斷為被測者提供某些疾病發生風險的評估意見。（三）傳染病病原體檢測適用情況①病原微生物的現場快速檢測，確定感染源；②病毒或致病菌的快速分型，明確致病性或藥物敏感性；③需要復雜分離培養條件，或目前尚不能體外培養的病原微生物的鑒定。（四）療效評價和用藥指導PCR等基因診斷技術已成為臨床上檢測和跟蹤微小殘留病灶的常規方法。通過對不同藥物代謝基因靶點的藥物遺傳學檢測，將為真正實現個體化用藥提供技術支撐。（五）DNA指紋鑒定——法醫學個體識別微衛星DNA等重復序列在不同個體間的重復次數不同。這些重復序列經酶切或PCR擴增，通過分子雜交，不同個體可獲得大小不等的雜交帶，其數目和分子量大小具有個體特異性，猶如指紋之千差萬別而被名之為DNA指紋（finger-rinting）。第二節基因治療GeneTherapy是以改變遺傳物質為基礎的生物醫學治療，即通過一定方式將人正常基因或有治療作用的DNA片段導入人體靶細胞以矯正或置換致病基因的治療方法。它針對的是疾病的根源，即異常的基因本身。基因治療的定義一、基因治療的基本策略（一）缺陷基因精確的原位修復基因矯正genecorrection基因置換genereplacement對致病基因的突變堿基進行糾正用正常基因通過重組原位替換致病基因這兩種方法既不破壞整個基因組的結構，又可達到治療疾病的目的，是最理想的治療方法。（二）基因增補不刪除突變的致病基因，而在基因組的某一位點插入正常基因，在體內表達出功能正常的蛋白質，達到治療疾病的目的。這種對基因進行異位替代的方法稱為基因添加（geneaugmentation）或稱基因增補，是目前臨床上使用的主要基因治療策略。（三）基因沉默或失活有些疾病是由于某一或某些基因的過度表達引起，向患者體內導入有抑制基因表達作用的核酸，如反義RNA、核酶、干擾小RNA等，可降解相應的mRNA或抑制其翻譯，阻斷致病基因的異常表達，從而達到治療疾病的目的。這一策略稱為基因失活（geneinactivation）或基因沉默（genesilencing）。二、基因治療的基本程序可分為5個步驟：①選擇治療基因②選擇攜帶治療基因的載體③選擇基因治療的靶細胞④在細胞和整體水平導入治療基因⑤治療基因表達的檢測（一）選擇治療基因分泌性蛋白質如生長因子、多肽類激素、細胞因子、可溶性受體；非分泌性蛋白質如受體、酶、轉錄因子等基因。簡言之，只要清楚致病基因，就可用相應的正常基因或經改造的基因作為治療基因。（二）選擇載體包括兩大類：病毒載體（多用）非病毒載體野生型病毒必須經過改造，剔除其復制必需的基因和致病基因，消除其感染和致病能力。目前用作為載體的病毒有：逆轉錄病毒（retrovirus）腺病毒（adenovirus）腺相關病毒（adeno-associatedvirus,AAV）單純皰疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）等1.逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒屬于RNA病毒，其基因組中有編碼逆轉錄酶和整合酶（integrase）的基因。優點：基因轉移效率高細胞宿主范圍較廣泛DNA整合效率高缺點：感染病毒的可能

增加腫瘤發生機會2.腺病毒載體DNA病毒，可引起上呼吸道和眼部上皮細胞感染。安全性高轉染效率高可用細胞范圍廣缺點基因組較大，構建復雜不能長期表達免疫原性較強，易被排斥優點（三）選擇靶細胞通常是體細胞，包括病變組織細胞和正常細胞。1.造血干細胞：具有高度自我更新能力的細胞，可分化為其他血細胞，并能保持基因組DNA的穩定。2.皮膚成纖維細胞：易采集、可在體外擴增培養、易移植。3.肌細胞：有特殊的T管系統，利于質粒DNA經內吞進入。質粒不整合入基因組，能在肌細胞內較長時間保留。（四）將治療基因導入人體將外源基因直接注入體內組織器官，使其進入細胞并表達。基因遞送genedelivery間接體內療法exvivo直接體內療法invivo從體內取出靶細胞，培養（攜帶治療基因）篩選擴大繁殖回輸體內，治療基因在體內表達重組體導入基因導入細胞生物學法非生物學法病毒載體介導法特點：

基因轉移效率高，

但安全問題需要重視。物理或化學法特點：

操作簡單、安全

但是轉移效率低。（五）治療基因表達的檢測無論以何種方法導入基因，都需要檢測這些基因是否能被正確表達。方法：PCRRNA印跡蛋白印跡ELISADNA印跡技術：檢測基因是否整合到基因組及整合部位三、基因治療的臨床應用現狀1.單基因遺傳病的基因治療單基因遺傳病：只受一對等位基因影響而發生的疾病。設計方案相對容易，例如鐮刀狀紅細胞性貧血、α-地中海貧血、血友病等。基本方法：通過一定手段把正常基因導入到患者體內，表達出正常功能蛋白