熒光原位雜交實驗第一頁，共十九頁，2022年，8月28日一、實驗目的通過實驗了解熒光原位雜交技術的基本原理和在生物學、醫學領域的應用。掌握原位雜交技術的操作方法，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法。第二頁，共十九頁，2022年，8月28日二、實驗原理FISH的基本原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。第三頁，共十九頁，2022年，8月28日三、實驗用具及材料

Y染色體探針、人外周血中期染色體細胞標本、恒溫水浴鍋、培養箱、染色缸、載玻片、NikonE-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、20μL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。

第四頁，共十九頁，2022年，8月28日四、實驗方法及步驟

第五頁，共十九頁，2022年，8月28日1.探針及標本的變性

探針變性：標本變性：第六頁，共十九頁，2022年，8月28日2.雜交

DNA探針10μL滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過夜（約15～17h）。

第七頁，共十九頁，2022年，8月28日3.洗脫

第八頁，共十九頁，2022年，8月28日4.雜交信號的放大

第九頁，共十九頁，2022年，8月28日5.封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70的冰箱中的暗盒中保持數月之久。

第十頁，共十九頁，2022年，8月28日6.熒光顯微鏡觀察FISH結果

先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發光源，FITC的激發波長為490nm。細胞被PI染成紅色，而經FITC標記的探針所在的位置發出綠色熒光。本實驗使用的是Y染色體上的特異序列，因此在男性外周血染色體標本的雜交中呈陽性，即使在未分裂的細胞中，也可以觀察到明顯的雜交信號。照相記錄實驗結果。

第十一頁，共十九頁，2022年，8月28日觀察結果(a)間期細胞(b)中期細胞，Y染色體熒光標記探針

第十二頁，共十九頁，2022年，8月28日五、作業及思考題

1.通過實驗總結熒光原位雜交實驗的技術關鍵。2.實驗中會不會出現假陽性，為什么？

第十三頁，共十九頁，2022年，8月28日第十四頁，共十九頁，2022年，8月28日第十五頁，共十九頁，2022年，8月28日第十六頁，共十九頁，2022年