含生物堿類成分中藥制劑的分析第1頁/共41頁

第一節生物堿alkaloid類成分分析

了解生物堿的理化性質熟悉中藥制劑內Alk定性鑒別的原理方法掌握Alk的供試液的提取純化制備方法、定量測定的原理和方法

第2頁/共41頁一、概述（了解）生物堿是中藥中重要的有效成分之一。多具復雜的環狀結構，有顯著的生理作用。至少有豆科、防已科、毛茛科、夾竹桃科、茄科、石蒜科50多科，120屬以上植物中有生物堿存在。以雙子葉植物最多，其次單子葉植物，裸子植物。以罌粟科等的植物分布較多。生物堿的種類很多(見表1)，但具生理活性大多集中在異喹啉、吲哚、茛菪烷類等衍生物。多以鹽的形式存在于植物體內。第3頁/共41頁序號類型基本結構植物藥舉例1、吡咯類a古豆、狗舌草2、吡啶類b毒芹、一葉秋、煙草3、喹啉類c

多雞納4、異喹啉類d黃連、罌粟、吐根、石蒜5、吲哚類e

番木鱉、毒扁豆、蘿芙木6、咪唑類f毛果蕓香生物堿類型及其基本結構

第4頁/共41頁生物堿類型及其基本結構6咪唑類f毛果蕓香7喹唑酮類g

常山8嘌啉類h茶葉9甾體類j

澳洲茄10莨菪烷類k顛茄、洋金花、古柯11無環類

麻黃12其他

烏頭、秋水仙第5頁/共41頁生物堿類型及其基本結構abcdefgIjK第6頁/共41頁與中藥化學差別(1)用量不同：分析一般樣品量小。

(2)提取的原則不同：分析是保證待測組分的最大回收。

(3)分離目的不同：分析是盡量排除干擾，凈化待測組分。

(4)定性目的不同第7頁/共41頁二、理化性質與提取分離1、物理性質一般無色結晶固體，少數為非結晶形粉未，少數有色。2、旋光性多具手性碳原子，所以多具有旋光性，且多為左旋。第8頁/共41頁二、理化性質與提取分離3、酸堿性：分子中含N原子，多具有堿性。

堿性：胍＞季銨堿＞烷胺類(脂叔胺堿)＞吡啶(芳叔胺堿)＞酰胺類。

Sp3＞Sp2＞Sp1

第9頁/共41頁4、溶解性游離生物堿：極性較小，不溶或難溶于水能溶于乙醇、氯仿、丙酮、乙醚等有機溶媒中分析中常用氯仿、乙醚作為提取溶劑生物堿的鹽類：大多易溶于水及醇不溶于或難溶于苯、氯仿、乙醇等該性質是相反的，可用來提取、分離、精制生物堿但需注意：季胺堿、酰胺堿、和一些含極性基團較多的Alk則能溶于水含酚羥基、和羧基的生物堿呈酸堿兩性反應

二、理化性質與提取分離第10頁/共41頁二、理化性質與提取分離5、沉淀反應Alk在H＋水液或H＋稀醇(＜50％）中，與Alk↓試劑生成難溶性↓精制協助鑒定但蛋白質、肽類、鞣質、嘌呤類，有的黃酮、香豆素及查耳酮也可與某些Alk↓試劑反應，實驗中需排除這些干擾。含Alk樣品液純化精制后，再進行實驗。

第11頁/共41頁二、理化性質與提取分離OH－

水洗

H＋酸性水液

Alk沉淀試劑(3種)第12頁/共41頁生物堿沉淀沉淀試劑大體可分為三類

(1)與Alk生成不溶性鹽類如：磷鉬酸、硅鎢酸(Alkertrand)、磷鎢酸；

(2)與Alk形成疏松的絡鹽如：碘－碘化鉀試劑(Wagner)；

(3)與Alk的氮原子反應，生成不溶性加成物如：碘化鉍鉀(Dragendorff)、碘化汞鉀試劑(Mayer)。

二、理化性質與提取分離第13頁/共41頁6、顯色反應有些Alk與某些試劑呈顏色反應，可借以識別Alk，但易雜質干擾，需凈化后進行。

7、生物堿供試液的提取主根據Alk的溶解度而定。

(1)有機溶劑提取氨水濕潤Alk游離，后用CHCl3、(CH3CH2)2O提取較穩定的生物堿鹽類，可用堿性較強的NaCO3、Ca(OH)２、NaOH堿化本法缺點是不能提出水溶性生物堿

二、理化性質與提取分離第14頁/共41頁(2)醇水溶媒提取

用中性甲醇、乙醇、酸性甲醇、乙醇、酸水(如：0.1～1%)鹽酸、硫酸、酒石酸等提取。

此法較簡便，但提取出的雜質較多，需進一步純化處理。

(3)混合溶媒提取用不同極性的溶劑按不同比列混合，該法可以較好地提取出待測組分。如：百部、粉防已用乙醚:氯仿:乙醇:10%NH3OH(25：8：25：1)。

二、理化性質與提取分離第15頁/共41頁二、理化性質與提取分離(4)水溶性Alk：可用Alk沉淀試劑如雷氏鹽(硫氰化鉻銨)、磷鎢酸等生成不溶性的復鹽而從水中析出,沉淀溶于丙酮，通過陽離子交換樹脂，氫氧化銨洗脫，可得游離生物堿(5)生物堿樣品的提取方法常用的有：冷浸法、滲漉法、超聲提取法、索氏提取法、熱回流提取法等冷浸法與冷浸超聲提取法操作簡便、快捷，常用必要時，要對上述方法作比較，以優選出最佳提取方法。

第16頁/共41頁8、生物堿樣品預處理——精制

(1)萃取法酸堿萃取法——經典法

Alk離子對萃取法，依據離子對萃取原理

生物堿在弱酸性介質→陽離子+大分子(離子對試劑)→復鹽（水溶性小，溶于有機溶劑）

與水溶性雜質分離若離子對試劑為有機染料，則該法還可用于生物堿的定量分析，如：小蘗堿可加入pH8.5的四溴酚酞乙酯緩沖液，CH2Cl2萃取，取CH2Cl2液比色測定。

(2)色譜法——柱色譜、色譜小柱二、理化性質與提取分離第17頁/共41頁三、定性鑒別（一）一般理化鑒別常用鑒別有：Alk的沉淀反應、特殊顯色反應、色譜鑒別等l、Alk的沉淀反應三種以上試劑呈陽性反應。注意干擾2、特殊顯色反應(1)對二甲氨基苯甲醛試劑――吲哚類顯藍(2)小蘗堿――鹽酸過氧化氫試劑，呈紅紫(3)Vitali――醇制KOH試劑，莨菪烷類呈紫(4)Labat反應――次亞甲二氧基反應(5)雙縮脲反應――麻黃堿呈紫色第18頁/共41頁（二）色譜鑒別方法：TLC、PC、HPLC、GC等。多用TLC法。

中藥名吸附劑展開劑顯色方法黃連、黃柏(小蘗堿)硅膠G

正丁醇:醋酸:水(7:2:1)氯仿:甲醇(4:1)改良碘化鉍鉀試劑或紫外燈365nm麻黃(麻黃堿)硅膠G氯仿：甲醇：濃氨水(20：5：0.5)正丁醇：醋酸：水(4：1：1滴)0.5%茚三酮試劑元胡(延胡索乙素)硅膠G或乙醚：環已烷：甲醇(5：3：0.5)硅膠H:已烷:氯仿:甲醇:二已烷(5:3:0.5:l)改良碘化鉍鉀試劑烏頭(烏頭堿)堿性氧化鋁乙醚：石油醚(10:1碘蒸氣第19頁/共41頁早期常用的有：酸堿滴定法、沉淀法、酸性染料比色法、雷氏鹽比色法等

現用：分光光度法、TLC、HPLC、GC等（一）總生物堿含量測定1、經典化學法(重量法、容量法)(1)重量法原理：Alk可與生物堿沉淀試劑定量反應生成沉淀，根據沉淀量可間接求出生物堿含量。此法操作較繁，費時、且準確度較差四、含量測定方法第20頁/共41頁四、含量測定方法適用范圍：凡堿性很弱多不宜用容量法或其他方法測定者揮發性生物堿不宜用此法例苦參總堿測定：硅鎢酸沉淀法苦參片→20%NaOH堿化→氯仿回流提取→稀鹽酸溶解→定容→10%硅鎢酸沉淀→過濾沉淀→沉淀干燥稱重，計算含量第21頁/共41頁(2)容量法分類：酸堿滴定、兩相滴定、絡合滴定、沉淀容量法等

I、酸堿滴定原理生物堿呈堿性，可用酸滴定；pH指示劑指示終點。生物堿鹽，一般呈酸性(強酸弱堿鹽)，可用強堿滴定。因其終點在70-90%乙醇中比在水中明顯，故可用標準堿的醇溶液滴定，以酚酞為指示劑指示終點四、含量測定方法第22頁/共41頁四、含量測定方法II、兩相滴定原理離子離子分子在水相與水不相溶的有機溶劑(氯仿應用最多)兩相中進行滴定注意選擇：合適的PH，合適的酸性染料，合適的有機溶劑，以PH最為重要。第23頁/共41頁四、含量測定方法a、兩相酸堿滴定法：生物堿鹽溶于水，加適量氯仿等有機溶劑，NaOH滴定，酚酞指示劑指示終點。滴定產生游離生物堿轉溶有機溶劑，所以靈敏度比一般酸堿滴定好，又稱為兩相置換滴定b、兩相酸性染料滴定法：

用酸性染料為滴定劑，在水與氯仿兩相中滴定生物堿，Alk陽離子與酸性染料陰離子締合進入氯仿（等有機溶劑），終點時，稍過量酸性染料使水層產生顏色指示終點。利用氯仿層可比色定量。

第24頁/共41頁四、含量測定方法III、絡合滴定原理用過量的重金屬生物堿沉淀試劑，使生物堿沉淀，將沉淀溶解，然后用絡合劑滴定沉淀中重金屬先用過量重金屬生物堿沉淀試劑，使生物堿沉淀，后用絡合劑滴定溶液中剩余的過量重金屬生物堿沉淀試劑，而間接定量。繁瑣少用Ⅳ、沉淀容量法利用生物堿與生物堿沉淀試劑的反應，直接或間接定量第25頁/共41頁2、光譜法定量（1）直接測定（2）比色法（可見分光光度法）酸性染料比色法、雷氏鹽比色法、苦味酸比色法

第26頁/共41頁I

、酸性染料比色法

原理：與酸性染料滴定法相同本法關鍵：pH值、酸性染料種類、有機溶劑常用染料：甲基橙、溴麝香草酚藍BTB、溴甲酚綠、溴酚藍、溴甲酚紫等有機溶劑選擇：依據離子對與有機相能否形成氫鍵以及形成氫鍵能力的強弱常用有機溶劑：氯仿、二氯甲烷注意：微量水份可使有機相混濁，影響比色，應先脫水后測定（2）比色法（可見分光光度法）第27頁/共41頁II

、雷氏鹽比色法

原理：Alk與雷氏鹽生成紅色沉淀，此沉淀溶于丙酮，于520-526nm波長處，選擇最大吸收波長，測定吸收度。根據雷氏鹽丙酮液的ε為106.5(單鹽)或203.0(雙鹽)。按下式計算樣品生成雷氏鹽重量（W，g）。（2）比色法（可見分光光度法）第28頁/共41頁IV、其它比色法苦味酸比色法方法：沉淀加堿解離，以有機溶劑提出生物堿，將苦味酸的堿性水溶液進行比色氯仿提取苦味酸生物堿鹽，堿性緩沖液使鹽解離，并將苦味酸提取而進行比色氯仿提取苦味酸鹽而直接進行比色。（2）比色法（可見分光光度法）Ⅲ、異羥肟酸鐵比色法酯鍵結構→堿性加熱水解→羧基+羥胺→異羥肟酸+Fe3+→異羥肟酸鐵（紫紅色化合物）如：烏頭總生物堿的測定第29頁/共41頁主要有HPLC、GC、TLC等

1、TLC法對樣品純化程度要求不高。但一般點樣誤差大，定量時，首先作一標準曲線，考察線性范圍，確定定量方法(內標/外標、一點法/二點法)，均需同板標準品隨行對照。同時要考察方法的穩定性、同板與異板的精密度

（二）單體生物堿的含量測定第30頁/共41頁2、HPLC法生物堿鹽為離子型化合物.∴有離子交換、離子對、正相HPLC法。生物堿為分子型化合物，∴可用反相、分配HPLC法，應用較多。注意：在Alk分析中，反相柱硅膠表面仍殘留有游離的硅醇羥基，呈弱酸性，會吸附堿性的生物堿使色譜峰拖尾克服措施：

I、固定相

通常硅醇羥基被覆蓋率越高，分離效果越好。如用C8比C18好。

第31頁/共41頁2、HPLC法II、流動相

為減小ALK在反相柱上的拖尾，可采取如下措施：

a、加入有機胺類：

常加入三乙胺或季胺堿鹽。

使流動相呈堿性，抑制或掩蔽游離硅醇羥基影響。

b、在流動相中加入離子對試劑：

與ALK類成分生成離子對掩蔽其堿性基使之不能與固定相表面的硅醇基作用，使ALK類成分易于出峰，且峰形好。第32頁/共41頁c、增加流動相的脂溶性

d、調整流動相的pH值III、柱溫

升高柱溫Ⅳ、樣品液的制備是定量分析工作是否成功的關鍵兩大類：溶劑萃取法、色譜分離法2、HPLC法第33頁/共41頁3、

GC法：適于有揮發性，遇熱不分解的生物堿類如麻黃堿、苦參堿和顛茄類生物堿例：潔爾陰洗劑中苦參堿的測定4、其他測定方法（二）單體生物堿的含量測定第34頁/共41頁五、應用實例1、含小檗堿的中藥制劑分析

(1)萬氏牛黃清心丸

TLC法鑒別鹽酸小檗堿UV法/一階導數光譜法測定鹽酸小檗堿

(2)安宮牛黃丸

HPLC法測定鹽酸小檗堿

(3)香連丸

HPLC法

第35頁/共41頁五、應用實例2、含麻黃堿的中藥制劑分析

麻黃堿性質：揮發性堿性較強可與大多數生物堿沉淀試劑發生反應可與金屬離子Cu2+、Ni2+、Co2+在CS2堿性條件形成棕或黃色沉淀，溶解在苯-丙酮（1：1）溶液中————定性鑒別含量測定。第36頁/共41頁五、應用實例實例：1）復方川貝精片化學和薄層色譜鑒別2）疏風定痛丸