組員(zǔyuán)：陳忠浩、趙靜杰、郭獻貴、于芳萍發言人：郭獻貴血清γ球蛋白的分離(fēnlí)純化與鑒定第一頁，共二十五頁。Contents材料(cáiliào)與方法結果(jiēguǒ)與討論總結(zǒngjié)與感想第二頁，共二十五頁。2一、材料(cáiliào)與方法（一）試驗(shìyàn)材料1、供試材料(cáiliào)采用豬血為實驗材料，采自寧波方興食品有限公司屠宰場。收集健康肉豬頸動脈血液，室溫下放置1-2h，析出血清，于4℃、8000r/min離心10min，除去血球和纖維蛋白原后，取上層血清，-20℃冰箱內保存備用。第三頁，共二十五頁。32、主要(zhǔyào)試劑

試劑名稱規格出產廠家三氯醋酸正辛酸氯化鈉氫氧化鈉鹽酸Tris無水乙醇醋酸分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純上海光鏵科技有限公司衢州巨化試劑有限公司天津市永大化學試劑開發中心上海三鷹化學試劑有限公司浙江中星化工試劑有限公司浙江中星化工試劑有限公司杭州瓶窯和順化工試劑廠浙江中星化工試劑有限公司第四頁，共二十五頁。4試劑名稱規格出產廠家考馬斯亮藍甘油巰基乙醇SDS甘氨酸溴酚藍DEAE52過硫酸銨乙酸鋇分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純浙江中星化工試劑有限公司無錫市龍吉化工試劑有限公司浙江中星化工試劑有限公司上海源聚生物科技有限公司天津市永大化學試劑開發中心浙江中星化工試劑有限公司安徽三星樹脂科技有限公司上海三鷹化學試劑有限公司浙江中星化工試劑有限公司第五頁，共二十五頁。53、儀器設備儀器名稱型號生產廠家紫外可見分光光度計S52恒達儀器廠電泳儀CS101上海精密科學儀器有限公司低速大容量離心機TDL-5上海安亭科學儀器廠高速萬能粉碎機FW100天津市泰斯特儀器有限公司數顯恒溫水浴鍋HH-2常州國華電器有限公司真空干燥箱DZF-6050上海一恒科技有限公司電子精密天平AB-L梅特勒－托利多儀器有限公司全溫振蕩（空氣）培養箱QYC-211上海福瑪實驗設備有限公司自動液相色譜分離層析儀MC99-3上海滬西分析儀器廠電熱恒溫鼓風干燥箱OHG-907385-Ⅲ上海新苗醫療器械制造有限公司酸度計DELTA-320梅特勒托利多儀器(上海)有限公司層析拄Φ1.0×30上海滬西分析儀器廠恒溫磁力攪拌器90-2上海亞榮生化儀器廠第六頁，共二十五頁。6A豬血清IgG的提取B

豬血清IgG的純化C提取液蛋白含量測定（二）試驗(shìyàn)方法D豬血清IgG分子量測定第七頁，共二十五頁。71、豬血清IgG的提取(tíqǔ)——正辛酸法準確量取豬血清40mL于500mL燒杯中，加入60mmol/LpH4.0醋酸緩沖液160mL，用氫氧化鈉溶液調pH4.5。以每毫升稀釋液加入25μL正辛酸的比例，在磁力攪拌條件下緩慢加入正辛酸，室溫攪拌30min，4℃，5000r/min離心30min，棄去沉淀。上清(shànɡqīnɡ)液4℃預冷，以1mL上清(shànɡqīnɡ)液加0.227g硫酸銨的比例，緩慢加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，室溫下繼續攪拌30min，5000r/min離心15min。將沉淀溶于20mL生理鹽水中，透析過夜，離心去沉淀，上清液即為粗提IgG。

第八頁，共二十五頁。82、豬血清(xuèqīng)IgG的純化將上述IgG粗品溶于少量(shǎoliàng)生理鹽水后裝入透析袋，懸于裝有0.01mol/L，pH7.4的PBS的大燒杯中，于磁力攪拌器上4℃透析24h，每6h換一次液。（1）透析脫鹽第九頁，共二十五頁。9取2g預處理的DEAE-52纖維素、裝成1.5×30cm，柱床高25cm層析柱。緩沖液A(25mmol/LTris-HCl，pH8.8，35mmol/LNaCl)平衡。取2mL上述透析去鹽母液進層析柱，上樣后先用緩沖液A平衡，至流出液在280nm波長洗脫曲線變得平直(pínɡzhí)止。以等量緩沖液A和緩沖液C(25mmol/LTris-HCl，pH8.8，500mmol/LNaCl)連續梯度洗脫；控制流速1mL/min。上樣15min后分步收集并記錄波峰，2mL/管，合并同一波峰收集管。再用PBS溶液透析，并進行分析鑒定。（2）DEAE-52纖維素離子交換(lízǐjiāohuàn)層析純化IgG第十頁，共二十五頁。103、提取液蛋白含量(hánliàng)測定——Folin-酚法配制標準牛血清白蛋白進行(jìnxíng)Folin-酚法實驗，用分光光度計測定梯度濃度標準蛋白的OD280。以蛋白質的濃度為橫坐標，OD280值為縱坐標，繪制標準曲線。各粗IgG樣品液定容至100mL，按Folin-酚法操作，通過標準曲線計算樣品的蛋白質濃度。第十一頁，共二十五頁。114、豬血清(xuèqīng)IgG分子量測定——SDS配制SDS凝膠。將透析過的IgG樣品液和標準蛋白液與上樣緩沖液混合(hùnhé)后在沸水浴中加熱5min，各取20μL加入凝膠板的樣品槽中，進行電泳。取出凝膠平板，將凝膠浸泡在染色液中，20min后用脫色液脫色。脫色后的凝膠在凝膠成像儀上拍照，分析，根據標樣做出標準曲線計算樣品IgG分子量。第十二頁，共二十五頁。12電泳(diànyǒnɡ)設備第十三頁，共二十五頁。13二、結果(jiēguǒ)與討論（一）正辛酸提取豬血清IgG試驗(shìyàn)結果

血清(xuèqīng)提取出的球蛋白粗品為淺黃色膠狀物質。（二）豬血清IgG純化結果透析后的蛋白質顏色明顯變淺，呈透明狀。1、IgG的透析結果第十四頁，共二十五頁。14保留時間(shíjiān)0-1.6h為緩沖液A洗脫第一峰；1.6h開啟緩沖液A-C線性梯度洗脫，獲得第二峰；圖示兩色譜峰分離效果較好，分辨率高，無重疊。2、DEAE-52纖維素層析(cénɡxī)純化IgG結果

用DEAE纖維素離子交換柱進行純化，以OD280nm為縱坐標，洗脫時間(shíjiān)為橫坐標，繪制洗脫色譜圖：第十五頁，共二十五頁。15圖福林－酚試劑法測蛋白質濃度標準(biāozhǔn)曲線（三）提取液蛋白(dànbái)含量測定結果1、標準(biāozhǔn)曲線第十六頁，共二十五頁。16

分別將低鹽峰和高鹽峰樣品吸光度代入蛋白質標準曲線(qūxiàn)，計算求得低鹽峰樣品蛋白質含量1.45mg/mL，高鹽峰樣品蛋白質含量為１.74mg/mL。2、樣品(yàngpǐn)IgG含量測定第十七頁，共二十五頁。17（四）SDS測IgG分子量結果(jiēguǒ)

豬血清、純化的IgG樣品經SDS電泳(diànyǒnɡ)結果如下：1標準蛋白(dànbái)2豬血清3純化的IgG樣品第十八頁，共二十五頁。18IgG樣品經預處理過程中巰基乙醇的作用而打開二硫鍵，還原成兩條單鏈，再進一步與SDS結合成帶大量負電荷的SDS-蛋白復合物，SDS電泳呈現兩條較濃的條帶。豬血清球蛋白經正辛酸法提取(tíqǔ)，DEAE純化后，所得IgG較純凈，基本無其它雜蛋白，表明該提取(tíqǔ)純化工藝能得到較純凈的免疫球蛋白。第十九頁，共二十五頁。191、標準(biāozhǔn)曲線制作以標準蛋白質相對分子質量的對數（lgMw）為縱坐標，蛋白質遷移距離(jùlí)為橫坐標，得到以下標準曲線。第二十頁，共二十五頁。202、IgG樣品(yàngpǐn)分子量測定結果根據(gēnjù)樣品IgG的遷移距離從標準曲線上查出其相對分子質量如下：重鏈約55000，輕鏈約24000。即豬血清IgG球蛋分子量為16萬左右，與文獻《蛋白質技術手冊》報道結果一致。第二十一頁，共二十五頁。21四、總結(zǒngjié)與感想總的來說，本次試驗還是成功的，雖然說試驗方法(fāngfǎ)在細節上還有很多需要改進的地方，但實驗目的已經達到。本次實驗課是一次不同于以往的自主性實驗課程，需要我們自己查找資料、設計實驗方案，更需要我們獨立思考、通過團隊合作完成實驗。第二十二頁，共二十五頁。22這種以學生為主，老師為輔的實驗課程讓我們想得更多，學得更多，得到的也更多。在我們開展討論的過程中，同學們互相學習，對實驗的設計流程有了深刻的認識。實驗其間，對于細節(xìjié)上的問題我們更加耐心，為將來畢業論文的開展提供了有力的基礎。第二十三頁，共二十五頁。23謝謝第二十四頁，共二十五頁。24內容(nèiróng)總結組員：陳忠浩、趙靜杰、郭獻貴、于芳萍。組員：陳