第三章基因工程第一節基因工程工具酶演示文稿當前1頁，總共36頁。優選第三章基因工程第一節基因工程工具酶當前2頁，總共36頁。（一）、限制修飾系統的種類1.

I型：由三個基因構成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因構成一個復合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。2.

II型：限制與修飾基因產物獨立起作用，在Ｅ.coli中這兩種基因位于質粒上。3.

III型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產物結合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。

上述三個系統中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。當前3頁，總共36頁。（二）、限制性內切酶的定義、命名

1.定義：廣義指上述三個系統中的限制酶；狹義指II型限制酶。

2.

命名：限制酶由三部分構成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：HindⅢ前三個字母來自于菌種名稱H.influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)當前4頁，總共36頁。（三）、限制酶的特點

1.識別順序和酶切位點１）識別４-8個相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’

外側，產生５’-端突起２）富含ＧＣ當前5頁，總共36頁。

３）對稱性—雙對稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點大多數在識別順序之內，也有例外５）限制酶切后產生兩個末端，末端結構是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

2.

末端種類

１）３’-端突起，個數為２或４個核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個數為２或４個核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’

粘性末端能與另一個相同的粘連末端相連接，任何兩個具有相同識別位點的DNA分子經限制酶切割后能夠重新連接成新的重組DNA分子。在進行DNA重組時，應用限制酶同時切割目的基因和載體DNA，使之產生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組DNA分子當前6頁，總共36頁。

３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補的粘性末端ａ）切點在識別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

當前7頁，總共36頁。

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列當前8頁，總共36頁。5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’當前9頁，總共36頁。

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）當前10頁，總共36頁。酶切條件：酶切緩沖液低鹽組：0～50mmol/LNaCl中鹽組：50～100mmol/LNaCl高鹽組：100～150mmol/LNaCl當前11頁，總共36頁。（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶

2.特點：1）識別相同順序

2）切割位點的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

當前12頁，總共36頁。（五）、限制酶的用途

1.

DNA重組

2.

限制酶（物理）圖譜繪制

3.

突變分析（RFLP分析）

4.限制酶的部分酶切與完全酶切附：IIS型限制酶的特點

1.

具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結構。

2.

酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側，1--20nt。

3.

酶切后的末端經補平后又可發生酶切反應。

4.

產生粘性末端可以是1--5個核苷酸。

5.

均為單體，分子量為47—108kD。當前13頁，總共36頁。酶切圖譜的構建（a）請構建該環狀DNA分子的酶切圖譜當前14頁，總共36頁。酶切圖譜的構建（b）當前15頁，總共36頁。二、DNA甲基化酶

（一）、甲基化酶的種類與識別順序1.

限制修飾系統I、II、III型中的甲基化酶三個系統中的甲基化酶可使細菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤發生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤。在DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同

M．HpaICmCGGHpaICCGG相同當前16頁，總共36頁。2.

II型甲基化酶對限制酶活性的影響

１）

抑制同種限制酶的活性

M.BamHIGGATmCC—BamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(GAATTC)

２）

抑制不同種限制酶的活性

a.順序完全重疊如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）

b.順序邊界重疊如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）

３）

抑制不同種限制酶的部分活性

M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.

甲基化酶的用途

１）

改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成２）

在建立基因文庫時，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切當前17頁，總共36頁。M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫的建立用于cDNA的連接RERERE當前18頁，總共36頁。三、核酸酶

（一）、外切酶III（ExoIII）

1.一般特點：

來自于E.coli，分子量28,000kD

2.催化反應類型

1)外切酶活性：3’→5’，產生5’-單磷酸核苷酸和具各種結構的ds-DNA，2)核酸酶H活性：除去DNA-RNA雜交分子中的RNA分子，3)3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反應，4)內切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將DNA鍵切開，當前19頁，總共36頁。

3.

外切酶活性特點

1)反應底物：互補ds-DNA2)堿基釋放速度：C>>A-T>>G3)反應產物：5’-單磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，過度反應將導致DNA降解

4.

用途

1)

核酸（DNA）標記

2)

基因突變----缺失

3)

DNA序列測定時作順序缺失

5.

使用注意事項

1)

正式使用前，測定在一定條件下酶的反應速度

2)

在一定條件下，ExoIII不能作用GC富集區(來自于cDNA加尾)當前20頁，總共36頁。ds-DNA結構:切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'當前21頁，總共36頁。5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用當前22頁，總共36頁。1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于順序缺失ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA標記當前23頁，總共36頁。（二）、RNase（三）、RNaseH（二）、RNase

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質合成系統中的RNA分子。

1.RNaseA

分離自牛胰臟，對熱穩定，抗去污劑（100℃加熱15min仍具活性）,用于除去DNA樣品中的RNA分子

2.核酸酶S7，亦稱微球菌核酸酶，對RNA敏感，用于除去蛋白質合成系統中的內源mRNA

（三）、RNaseH

作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。

當前24頁，總共36頁。（四）、DNaseI1.特點：具內切酶活性，作用于ds-DNA，但無核苷酸序列特異型，產生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+

或Ca2+,Mn2+可使酶活達最大值當酶濃度很低時，ds-DNA分子上將形成切口，不同類型二價陽離子對兩條鏈上切口位置形成有以下影響：Mg2+存在時，兩條鏈上的切口獨立無關，Mn2+存在時，兩條鏈上的切口幾乎在同一位置

2.用途

1)切口移位，制備DNA探針

2)制備RNA樣品時除去DNA分子

3)基因突變時產生切口

當前25頁，總共36頁。

Mn++存在時

Mg++存在時

DNaseI作用特點DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位PolI當前26頁，總共36頁。四、聚合酶包括DNA聚合酶和RNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（polI）

1.E.coli

的DNA聚合酶系統

PolI參與DNA修復,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

polII同上具3’→5’外切酶活性

polIII參與DNA復制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

2.E.colipolI的特點

1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延續性受反應條件的影響

3）外切酶活性

當前27頁，總共36頁。3.用途

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時）

2）補齊5’-突起端

3）合成第二條cDNA4）切口移位制備探針其中用途2)和3)常用大片段當前28頁，總共36頁。（二）、T4DNA聚合酶

1.特點：

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,為polI的兩倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分別為40和4000nt/min,缺少5’到3’的外切核酸酶活性.

2.

用途：

制備高比活性探針(1010cpm/μgDNA);DNA末端修飾---缺失

外切酶活性

聚合酶活性

無dNTPdNTP當前29頁，總共36頁。(三)T7噬菌體DNA聚合酶具3’到5’端外切核酸酶活性和持續合成能力較低的DNA聚合酶活性.應用:1)合成DNA能力很強,可用于延伸很長的模板.2)可用于定點誘變中互補鏈的合成.3)3’末端的標記4)將雙鏈DNA的黏性末端轉變為平端.當前30頁，總共36頁。（四）、TaqDNA聚合酶1.特點：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應溫度75℃，對95℃高溫具良好穩定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：

主要用于DNA的體外擴增，經25次循環后才進入酶的反應穩定期，一個DNA分子因而可被擴增4×106倍。

DNA擴增技術又稱為聚合酶鏈式反應，它包括以下三個步驟：

DNA模板變性(95℃)→

與DNA引物退火(45℃)→引物延伸(75℃)

當前31頁，總共36頁。TaqPol和PCR

5’3’