第第#頁共21頁內使用。4.2.2、陰性對照為確認試驗條件是否符合要求，應進行對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。4.2.3、培養基適用性檢查控制菌檢查用的培養基應進行培養基適用性檢查。控制菌檢查用的成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應進行培養基的適用性檢查。控制菌檢查用培養基適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。各培養基的檢查項目及所用菌株見下表4。表4控制菌檢查用培養基的促生長能力、抑制能力及指示特性控制菌檢杳培養基特性試驗菌株耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培養基促生長能力大腸埃希菌、銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基促生長能力+指示特性大腸埃希菌、銅綠假單胞菌大腸埃希菌麥康凱液體培養基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂培養基促生長能力+指示特性大腸埃希菌沙門菌RV沙門菌增菌液體培養基促生長能力乙型副傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基促生長能力+指示特性乙型副傷寒沙門菌三糖鐵瓊脂培養基指示能力乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌溴化十八烷基一甲銨瓊脂培主甘養基促生長能力銅綠假單胞菌抑制能力大腸埃希菌金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養基促生長能力+指示特性金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養基促生長能力生抱梭菌哥倫比亞瓊脂培養基促生長能力生抱梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養基促生長能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂培養基促生長能力+指示特性白色念珠菌念珠菌顯色培養基促生長冃匕力+扌日示冃匕力抑制能力白色念珠菌大腸埃希菌423.1、液體培養基促生長能力檢查分別接種不大于lOOcfu的表4的試驗菌株與被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下?培養，與對照培養基比較，被檢培養基試驗菌應生長良好。4.2.3.2、固體培養基促生長能力檢查用涂布法分別接種不大于100cfu的表2的試驗菌株與被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態應一致。423.3、培養基抑制能力檢查接種不少于lOOcfu的表2的試驗菌株與被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，試驗菌應不得生長。4.2.3.4、培養基指示特性的檢查用涂布法分別接種不大于lOOcfu的表2的試驗菌株與被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，被檢培養基上試驗菌生長的菌落大小、形態特征、指示劑能力等英語對照培養基一致。4.2.4、控制菌檢查方法適用性檢查424.1、供試液制備：按“供試品檢查”中規定的方法制備供試液。4.2.4.2、試驗菌根據各品種項下微生物限度標準中規定的檢查控制菌選擇相應的試驗菌株。確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法是，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。4.2.4.3、適用性檢查按控制菌檢查法取規定量供試液及不大于1OOcfu的試驗菌接入規定的培養基中，采用薄膜過濾法是取規定量供試液，過濾沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾后注入規定的培養基或取出濾膜接入規定的培養基中。依相應控制菌檢查方法，在規定的溫度和最短培養時間下培養，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。4.2.4.4、結果判斷上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液之被罰和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出試驗菌，應消除供試品中的抑菌活性（按微生物計數法中3.1.2.3項抗菌活性的去除或滅活），并重新進行方法適用性試驗。若經過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。4.3、供試品檢查供試品的控制菌檢查應經方法適用性試驗確認的方法進行。4.3.1陽性對照陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加入量應不大于lOOcfu，陽性對照應檢出相應的控制菌。4.3.2、陰性對照以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照應無菌生長。4.3.3、大腸埃希菌（EscherichiacOli4.331、供試液制備和增菌培養取供試品，照“微生物計數法”制成1:10的供試液，取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30?35°C培養18?24h。?4.332、選擇和分離培養取上述培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中，42?44°C培養24?48h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，30?35°C培養18?72h。4.3.3.3、結果判斷若麥康凱瓊脂培養基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。4.3.4、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）4.3.4.1、供試液制備和增菌培養取供試品，照“微生物計數法”制成1:10的供試液，取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30?35°C培養18?24h。4.3.4.2、選擇和分離培養取上述培養物1ml接種至溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基平板上，30?35°C培養18?72h。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其他適宜方法進一步鑒定。4.3.4.3、氧化酶試驗將潔凈的濾紙片置于平皿內，用無菌玻璃棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%鹽酸N,N-二甲基對苯二胺試液，在30秒內培養物呈粉紅色并逐漸變為紫紅色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。4.3.4.4、結果判斷若溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。若平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。4.3.5、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）4.3.5.1、供試液制備和增菌培養取供試品，照“微生物計數法”制成1:10的供試液，取相當于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30?35°C培養18?24h。4.3.5.2、選擇和分離培養取上述培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，30?35°C培養18?72h。4.3.5.3、結果判斷若甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上有黃色菌落或外周有黃色環的白色菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。4.3.6、沙門菌（Salmonella）4.3.6.1、供試液制備和增苗培養取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30?35°C培養18?24小時。?4.3.6.2、選擇和分離培養取上述培養物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養基中，30?35°C培養18?24小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，30?35°C培養18?48小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養18?24小時，或采用其他適宜方法進一步鑒定。4.3.6.3、結果判斷若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上有疑似菌落長，且三糖鐵瓊脂培養基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養基的斜面未見紅色、底層未見黃色、或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。4.3.7、梭菌（Clostridia）4.3.7.1、供試液制備和熱處理取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”制成1:10供試液。取相當于lg或1ml供試品的供試液2份，其中1份置80°C保溫10分鐘后迅速冷卻。4.3.7.2、增菌、選擇和分離培養將上述2份供試液分別接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的梭菌增菌培養基中，置厭氧條件下30?35°C培養48小時。取上述每一培養物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養基平板上，置厭氧條件下30?35°C培養48?72小時。4.3.7.3、過氣化氫酶試驗取上述平板上生長的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。4.3.7.4、結果判斷若哥倫比亞瓊脂培養基平板上有厭氧桿菌生長（有或無芽孢），且過氧化氫酶反應陰性的，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為梭菌；如果哥倫比亞瓊脂培養基平板上沒有厭氧桿菌生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，或過氧化氫酶反應陽性，判供試品未檢出梭菌。4.3.8、白色念珠菌（Candidaalbicans）4.3.8.1、供試液制備和增菌培養取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”制成1:10供試液。取相當于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的沙氏葡萄糖液體培養基中，混勻，30?35°C培養3?5天。4.3.8.2、選擇和分離取上述預培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，30?35°C培養24?48小時。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺褶。挑取疑似菌落接種至念珠菌顯色培養基平板上，培養24?48小時（必要時延長至72小時），或采用其他適宜方法進一步鑒定。4.3.8.3、結果判斷若沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上有疑似菌落生長，且疑似菌在念珠菌顯色培養基平板上生長的菌落呈陽性反應，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為白色念珠菌；若沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或疑似菌在念珠菌顯色培養基平板上生長的菌落呈陰性反應，判供試品未檢出白色念珠菌。4.3.9、耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile~TolerantGram-NegativeBacteria）4.3.9.1、供試液制備和預培養取供試品，用胰酪大豆胨液體培養基作為稀釋劑照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”制成1:10供試液，混勻，在20?25C培養，培養時間應使供試品中的細菌充分恢復但不增殖（約2小時）。4.391、定性試驗除另有規定外，取相當于lg或lml供試品的上述預培養物接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養基中，30?35°C培養24?48小時后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，30?35°C培養18?24小時。如果平板上無菌落長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。4.3.9.2、定量試驗4.3.921、選擇和分離培養取相當于0.1g、0.0lg和0.000lg（或0.1ml、0.01ml和0.001tnl）供試品的預培養物或其稀釋液分別接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養基中，30?35C培養24?48小時。上述每一培養物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，30?35*C培養18?24小時。4.3.9.1.2、結果判斷若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上有菌落生長，則對應培養管為陽性，否則為陰性。根據各培養管檢查結果，從表5查lg或lml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數。表5耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數（N）各供試品量的檢査結果每lg（或lml）供試品中可能的菌數cfu0.lg或0.lml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+++N>103++-102<N<103+--10<N<102N<10注：（1）+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長；一代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生長。（2）若供試品量減少10倍（如0.01lg或0.01ml，0.00lg或0.001ml，0，0001g或0.0001ml）,則每lg（或1ml）供試品中可能的菌數（N）應相應增加10倍。、稀釋液4.4.1、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀3.56g，無水磷酸氫二鈉5.77g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。4.4.2、磷酸鹽緩沖液（PH6.8）取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml,加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118ml，用水稀釋至1000ml,搖勻，過濾，分裝，滅菌。磷酸鹽緩沖液（PH7.2）取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液50ml與0.2mol/L氫氧化鈉溶液35ml，加新沸過的冷水稀釋至200ml，搖勻，過濾，分裝，滅菌。磷酸鹽緩沖液（PH7.6）取磷酸二氫鉀27.22g，加水使溶解成1000ml，取50ml，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液42.4ml，再加水稀釋至200ml，搖勻，過濾，分裝，滅菌。4.4.3、0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。5、限度標準非無菌藥品的微生物限度標準是基于藥品的給藥途徑和對患者健康潛在的危害以及藥品的特殊性而制訂的。藥品生產、貯存、銷售過程中的檢驗，藥用原料、輔料及中藥提取物的檢驗，新藥標準制訂，進口藥品標準復核，考察藥品質量及仲裁等，除另有規定外，其微生物限度均以本標準為依據。5.1、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑和原輔料應符合無菌檢查法規定。

5.2、用于手術、燒傷或嚴重創傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查法規定。5.3、非無菌化學藥品制劑、生物制品制劑、不含藥材原粉的中藥制劑的微生物限度標準（見表6）。表6非無菌化學藥品制劑、生物制品制劑、不含藥材原粉的中藥制劑的微生物限度標準給藥途徑需氧菌總數(cfu/g、cfu/ml或cfu/lOcm2)霉菌和酵母菌總數（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）控制菌口服給藥①固體制劑液體制劑103102102101不得檢出大腸埃希菌（1g或1ml）；含臟器提取物的制劑還不得檢出沙門菌（10g或10ml）口腔黏膜給藥制劑齒齦給藥制劑鼻用制劑102101不得檢出大腸埃希菌、金黃色匍萄球菌、銅綠假單胞菌（1g、1ml或10cm2）耳用制劑皮膚給藥制劑102101不得檢出大腸埃希菌、金黃色匍萄球菌、銅綠假單胞菌（1g、1ml或10cm2）呼吸道吸入給藥制劑102101不得檢出大腸埃希菌、金黃色匍萄球菌、銅綠假單胞菌、耐膽鹽革蘭陰性菌（1g或1ml）陰道、尿道給藥制劑102101不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌（1g、1ml或10cm2）；中藥制劑還不得檢出梭菌（1g、1ml或10cm2）直腸給藥固體制劑液體制劑103102不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（1g或1ml）其他局部給藥制劑102102不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（1g、1ml或10cm2）注：①化學藥品制劑和生物制品制劑若含有未經提取的動植物來源的成份及礦物質還

不得檢出沙門菌（10g或10ml）。非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表7）表7非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準給藥途徑需氧菌總數(cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2)霉菌和酵母菌總數（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）控制菌固體口服給藥制劑不含豆豉、神曲等發酵原粉含豆豉、神曲等發酵原粉104(丸劑3x104)1051025x102不得檢出大腸埃希菌（1g）；不得檢出沙門菌（10g）；耐膽鹽革蘭陰性菌應小于102cfu（1g）液體口服給藥制劑不含豆豉、神曲等發酵原粉含豆豉、神曲等發酵原粉5x102103102102不得檢出大腸埃希菌（1ml）；不得檢出沙門菌（10ml）；耐膽鹽革蘭陰性菌應小于10cfu（1ml）固體局部給藥制劑用于表皮或黏膜不完整用于表皮或黏膜完整103104102102不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（1g或10cm2）；陰道、尿道給藥制劑還不得白色念珠菌、梭菌（1g或10cm2）液體局部給藥制劑用于表皮或黏膜不完整用于表皮或黏膜完整102102102102不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（1ml）；陰道、尿道給藥制劑還不得白色念珠菌、梭菌（1ml）非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準（見表8）表8非無菌藥用原料及輔料微生物限度標準需氧菌總數cfu/g或cfu/ml）霉菌和酵母菌總數（cfu/g或cfu/mL）控制菌藥用原料及輔料103102*注*：未做統一規定。中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準（見表9）表9中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準需氧菌總數cfu/g或cfu/ml）霉菌和酵母菌總數（cfu/g或cfu/mL）控制菌中藥提取物103102*中藥研粉口服用貴細飲片、直接口服及泡服飲片**不得檢出沙門菌（10g）；耐膽鹽革蘭陰性菌應