三細胞工程基本技術第1頁/共116頁實驗室基本組成細胞工程實驗室它必須滿足三個基本的需要，即：

實驗準備，包括培養基配制，洗滌與滅菌等；

無菌操作；

控制培養。第2頁/共115頁第2頁/共116頁基本實驗室準備室：準備室的功能就是進行一切與實驗有關的準備工作。要求寬敞明亮，通風條件好。接種室：接種室的功能是進行無菌操作。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時間保持無菌。房間一般不宜過大，其規模根據實驗需要而定。接種室除了出入口和通氣口外，應行密閉。培養室：培養室的功能是對離體材料進行控制培養。其首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養室應保持干燥和清潔。第3頁/共115頁第3頁/共116頁輔助實驗室細胞學實驗室：其功能是對培養材料進行細胞學鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室：其功能是進行培養材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情況下可建立此實驗室。生化分析室：在以培養細胞產物為主要目的的實驗室中，應建立相應的分析化驗實驗室，以便于對培養物的有效成分隨時進行取樣檢查。第4頁/共115頁第4頁/共116頁實驗室布局的基本要求便于隔離、便于操作、便于滅菌、便于觀察。第5頁/共115頁第5頁/共116頁實驗用品及主要設備玻璃器皿常用器械細胞培養的主要設備第6頁/共115頁第6頁/共116頁玻璃器皿液體儲存瓶吸管離心管培養皿培養瓶與培養板其它器皿1第7頁/共115頁第7頁/共116頁常用器械解剖刀、鑷子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精燈等第8頁/共115頁第8頁/共116頁胞培養的主要設備基本設備：冰箱、天平、酸度計、、純水器、電爐、培養基分裝器、攪拌器。滅菌設備：蒸汽壓力滅菌鍋、烘箱、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。無菌操作設備：凈化工作臺、接種箱。光溫控制設備：時間程序控制器、空調及溫度感應器。細胞培養設備：培養設備根據需要而定，包括培養架、培養箱、搖床、生物反應器等。細胞學鑒定設備：光學研究顯微鏡、倒置顯微鏡等。

除上述基本設備外，如果有條件和需要還可配制攝影設備、生化分析設備等。第9頁/共115頁第9頁/共116頁無菌技術

無菌技術是一個技術體系，涉及多方面因素、多個環節，只有諸因素和環節都處理好，才能達到無菌。

培養基

器皿材料

接種工具

操作環境

培養室

工作臺面

具體的滅菌方法有多種

污染檢測與控制第10頁/共115頁第10頁/共116頁玻璃器皿清洗浸泡——刷洗——浸酸——沖洗第11頁/共115頁第11頁/共116頁無菌室無菌操作室和無菌培養室要求：墻壁光滑、地面平坦無縫，門窗密閉，無空氣對流第12頁/共115頁第12頁/共116頁滅菌種類物理滅菌：高溫高壓滅菌、干熱滅菌、射線輻照滅菌、過濾滅菌化學滅菌：熏蒸滅菌、消毒液滅菌（酒精、升汞、漂白粉、新潔爾滅、次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫）抗生素消毒：在動物細胞培養中，常采用青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制細菌、真菌等污染。根據滅菌對象選擇不同的滅菌方法第13頁/共115頁第13頁/共116頁高溫高壓滅菌原理：在121℃高溫和0.8kg/cm2-1.1kg/cm2的壓力下，一般持續15-20分鐘后，就可殺死一切微生物的營養體及其孢子。適用于器皿、工具、衣物和培養基滅菌。第14頁/共115頁第14頁/共116頁干熱滅菌法將物品放入烘箱，利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固而達到滅菌的目的。適用于玻璃器皿。第15頁/共115頁第15頁/共116頁射線滅菌紫外光常用于培養室和接種箱或超凈臺的滅菌。操作前開燈20分鐘可達到滅菌效果。第16頁/共115頁第16頁/共116頁過濾滅菌原理：將帶菌的液體或氣體通過孔徑小于0.45uM微孔裝置，使雜菌留在濾板上而液體或氣體進入無菌空瓶中，從而達到除菌目的。常用于不能以高溫高壓滅菌的培養液、有機物質溶液和酶液的除菌。組織培養中常用的過濾除菌器是濾膜過濾器，它清洗方便，過濾效果好。第17頁/共115頁第17頁/共116頁蒸滅菌用能殺死微生物的蒸汽進行滅菌，適用于無菌室的定期滅菌。常用的方法是將甲醛和高錳酸鉀混合后，產生大量蒸氣，以殺死微生物，效果較好。第18頁/共115頁第18頁/共116頁消毒液滅菌

依化學滅菌劑的不同而適用于不同場合的滅菌。

70%酒精幾乎適用于組織培養中如各種器皿、培養材料、無菌室、接種箱、工作臺、操作人員的手等；升汞、漂白粉、新潔爾滅、次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫、抗菌素等適用于培養材料的滅菌。第19頁/共115頁第19頁/共116頁室內滅菌2%的新潔爾滅擦洗，70%乙醇噴霧，

紫外燈照射約20分鐘定期用甲醛和高錳酸鉀熏蒸第20頁/共115頁第20頁/共116頁試劑和器皿的滅菌包括培養基、特殊藥品和所有無菌操作使用的器皿的滅菌培養基通常使用滅菌鍋通過高壓蒸汽滅菌進行滅菌第21頁/共115頁第21頁/共116頁污染檢測與控制細菌：可采用抗生素預防真菌：可采用抗真菌劑防治支原體：可采用抗生素、加溫處理（41℃）、使用支原體特異性血清病毒：脫毒細胞交叉污染：嚴格操作規程第22頁/共115頁第22頁/共116頁顯微技術顯微觀察技術：顯微操作技術：借助顯微操作儀采用細微玻璃針或用微吸管、微電極、微熱電偶等可進行細胞解剖、物質的抽取及注入、移植等操作。第23頁/共115頁第23頁/共116頁細胞觀察與分析細胞計數與活力分析細胞固定與染色觀察凋亡細胞觀察染色體分析第24頁/共115頁第24頁/共116頁細胞計數與活力分析采用血細胞計數法計數活力分析：

臺盼藍染色法：死細胞著色MTT：活細胞使其還原為蘭色，用酶標儀測定490nm處的光密度，計算細胞相對活力第25頁/共115頁第25頁/共116頁血球計數板第26頁/共115頁第26頁/共116頁計數法第27頁/共115頁第27頁/共116頁細胞固定與染色觀察細胞固定甲醇-醋酸FAACarnoy細胞染色蘇木精-伊紅（H.E)染色法Giemsa染色法Feulgen染色法考馬斯藍染色法免疫熒光法免疫過氧化物酶染色法第28頁/共115頁第28頁/共116頁凋亡細胞觀察形態觀察:生化分析:錨定蛋白:檢測凋亡早期PI:檢測晚期或死細胞分子技術:梯形電泳圖譜第29頁/共115頁PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面第30頁/共115頁第30頁/共116頁FITC-AnnexinV染色第31頁/共115頁第31頁/共116頁FITC-AnnexinV和PI染色第32頁/共115頁第32頁/共116頁梯形電泳圖譜第33頁/共115頁第33頁/共116頁染色體分析樣品處理:秋水仙素低滲處理固定化染色觀察第34頁/共115頁第34頁/共116頁細胞分離細胞初步分離差速離心分離法

單個細胞的獲得

軟瓊脂培養法和有限稀釋法

顯微操作分離法

流式細胞儀分離

激光捕獲顯微切割

免疫磁珠分離第35頁/共115頁第35頁/共116頁細胞保存與復蘇目前廣泛應用的細胞保存方法是低溫冷凍保存法預保留細胞經消化分散后，加入冷凍保護液，同時將細胞懸液稀釋按1ml/安瓿分裝細胞懸液，在火焰下將安瓿封口。將封口的安瓿放入慢凍機內，按1℃/min的速度緩慢冷凍，使溫度降至-25℃凍結好的安瓿放入CO2低溫冰柜或液氮罐中，溫度達-150—--190℃如果需要復蘇，可將安瓿取出后立即放入37℃水浴中，使其快速融化第36頁/共115頁第36頁/共116頁思考題植物組織培養的基本實驗室有哪些？實驗室布局的基本要求是什么？消毒滅菌種類有哪幾類？

使用高壓鍋的基本步驟是什么？用血球計數板進行計數時，細胞數/L=N*25/5*10*10^6*稀釋倍數，N指什么？對細胞進行染色體分析中，樣品處理時加秋水仙素起什么作用？簡述細胞低溫冷凍保存的方法第37頁/共115頁第三章、細胞工程基本技術第38頁/共115頁第38頁/共116頁基本技術實驗室條件無菌技術

顯微技術細胞觀察與分析細胞分離細胞保存與復蘇第39頁/共115頁第39頁/共116頁實驗室條件

實驗室基本組成實驗用品及主要設備第40頁/共115頁第40頁/共116頁實驗室基本組成細胞工程實驗室它必須滿足三個基本的需要，即：

實驗準備，包括培養基配制，洗滌與滅菌等；

無菌操作；

控制培養。第41頁/共115頁第41頁/共116頁基本實驗室準備室：準備室的功能就是進行一切與實驗有關的準備工作。要求寬敞明亮，通風條件好。接種室：接種室的功能是進行無菌操作。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時間保持無菌。房間一般不宜過大，其規模根據實驗需要而定。接種室除了出入口和通氣口外，應行密閉。培養室：培養室的功能是對離體材料進行控制培養。其首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養室應保持干燥和清潔。第42頁/共115頁第42頁/共116頁輔助實驗室細胞學實驗室：其功能是對培養材料進行細胞學鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。攝影室及暗室：其功能是進行培養材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情況下可建立此實驗室。生化分析室：在以培養細胞產物為主要目的的實驗室中，應建立相應的分析化驗實驗室，以便于對培養物的有效成分隨時進行取樣檢查。第43頁/共115頁第43頁/共116頁實驗室布局的基本要求便于隔離、便于操作、便于滅菌、便于觀察。第44頁/共115頁實驗用品及主要設備玻璃器皿常用器械細胞培養的主要設備第45頁/共115頁第45頁/共116頁玻璃器皿液體儲存瓶吸管離心管培養皿培養瓶與培養板其它第46頁/共115頁第46頁/共116頁培養器皿1第47頁/共115頁第47頁/共116頁培養器皿2第48頁/共115頁第48頁/共116頁常用器械解剖刀、鑷子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精燈等第49頁/共115頁第49頁/共116頁常用器械第50頁/共115頁第50頁/共116頁細胞培養的主要設備基本設備：冰箱、天平、酸度計、、純水器、電爐、培養基分裝器、攪拌器。滅菌設備：蒸汽壓力滅菌鍋、烘箱、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。無菌操作設備：凈化工作臺、接種箱。光溫控制設備：時間程序控制器、空調及溫度感應器。細胞培養設備：培養設備根據需要而定，包括培養架、培養箱、搖床、生物反應器等。細胞學鑒定設備：光學研究顯微鏡、倒置顯微鏡等。

除上述基本設備外，如果有條件和需要還可配制攝影設備、生化分析設備等。第51頁/共115頁第51頁/共116頁電子天平

第52頁/共115頁第52頁/共116頁酸度計

第53頁/共115頁第53頁/共116頁不銹鋼蒸餾水器第54頁/共115頁第54頁/共116頁雙重蒸餾水器第55頁/共115頁第55頁/共116頁磁力攪拌器第56頁/共115頁第56頁/共116頁滅菌鍋第57頁/共115頁第57頁/共116頁滅菌鍋

第58頁/共115頁第58頁/共116頁烘箱第59頁/共115頁第59頁/共116頁過濾滅菌裝置第60頁/共115頁第60頁/共116頁紫外燈

第61頁/共115頁第61頁/共116頁超凈工作臺

第62頁/共115頁第62頁/共116頁培養架

第63頁/共115頁第63頁/共116頁光照培養箱

第64頁/共115頁第64頁/共116頁搖床第65頁/共115頁第65頁/共116頁生物反應器1第66頁/共115頁第66頁/共116頁生物反應器2第67頁/共115頁第67頁/共116頁植物細胞培養反應器第68頁/共115頁第68頁/共116頁顯微鏡第69頁/共115頁第69頁/共116頁無菌技術

無菌技術是一個技術體系，涉及多方面因素、多個環節，只有諸因素和環節都處理好，才能達到無菌。

培養基

器皿材料

接種工具

操作環境

培養室

工作臺面

具體的滅菌方法有多種

污染檢測與控制第70頁/共115頁第70頁/共116頁玻璃器皿清洗浸泡——刷洗——浸酸——沖洗第71頁/共115頁第71頁/共116頁常用器械第72頁/共115頁第72頁/共116頁無菌室無菌操作室和無菌培養室要求：墻壁光滑、地面平坦無縫，門窗密閉，無空氣對流第73頁/共115頁第73頁/共116頁培養室1第74頁/共115頁第74頁/共116頁培養室2第75頁/共115頁第75頁/共116頁工作臺面第76頁/共115頁第76頁/共116頁滅菌種類物理滅菌：高溫高壓滅菌、干熱滅菌、射線輻照滅菌、過濾滅菌化學滅菌：熏蒸滅菌、消毒液滅菌（酒精、升汞、漂白粉、新潔爾滅、次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫）抗生素消毒：在動物細胞培養中，常采用青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制細菌、真菌等污染。根據滅菌對象選擇不同的滅菌方法第77頁/共115頁第77頁/共116頁高溫高壓滅菌原理：在121℃高溫和0.8kg/cm2-1.1kg/cm2的壓力下，一般持續15-20分鐘后，就可殺死一切微生物的營養體及其孢子。適用于器皿、工具、衣物和培養基滅菌。第78頁/共115頁第78頁/共116頁干熱滅菌法將物品放入烘箱，利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固而達到滅菌的目的。適用于玻璃器皿。第79頁/共115頁第79頁/共116頁烘箱第80頁/共115頁射線滅菌紫外光常用于培養室和接種箱或超凈臺的滅菌。操作前開燈20分鐘可達到滅菌效果。第81頁/共115頁第81頁/共116頁過濾滅菌原理：將帶菌的液體或氣體通過孔徑小于0.45uM微孔裝置，使雜菌留在濾板上而液體或氣體進入無菌空瓶中，從而達到除菌目的。常用于不能以高溫高壓滅菌的培養液、有機物質溶液和酶液的除菌。組織培養中常用的過濾除菌器是濾膜過濾器，它清洗方便，過濾效果好。第82頁/共115頁第82頁/共116頁過濾除菌裝置第83頁/共115頁第83頁/共116頁熏蒸滅菌用能殺死微生物的蒸汽進行滅菌，適用于無菌室的定期滅菌。常用的方法是將甲醛和高錳酸鉀混合后，產生大量蒸氣，以殺死微生物，效果較好。第84頁/共115頁第84頁/共116頁消毒液滅菌

依化學滅菌劑的不同而適用于不同場合的滅菌。

70%酒精幾乎適用于組織培養中如各種器皿、培養材料、無菌室、接種箱、工作臺、操作人員的手等；升汞、漂白粉、新潔爾滅、次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫、抗菌素等適用于培養材料的滅菌。第85頁/共115頁第85頁/共116頁室內滅菌2%的新潔爾滅擦洗，70%乙醇噴霧，

紫外燈照射約20分鐘定期用甲醛和高錳酸鉀熏蒸第86頁/共115頁第86頁/共116頁試劑和器皿的滅菌包括培養基、特殊藥品和所有無菌操作使用的器皿的滅菌培養基通常使用滅菌鍋通過高壓蒸汽滅菌進行滅菌第87頁/共115頁滅菌鍋種類

立式、臥式和手提式操作步驟：加水裝料密封排氣升壓滅菌降壓取物品放水第88頁/共115頁第88頁/共116頁污染檢測與控制細菌：可采用抗生素預防真菌：可采用抗真菌劑防治支原體：可采用抗生素、加溫處理（41℃）、使用支原體特異性血清病毒：脫毒細胞交叉污染：嚴格操作規程第89頁/共115頁第89頁/共116頁顯微技術顯微觀察技術：顯微操作技術：借助顯微操作儀采用細微玻璃針或用微吸管、微電極、微熱電偶等可進行細胞解剖、物質的抽取及注入、移植等操作。第90頁/共115頁第90頁/共116頁顯微操作儀1第91頁/共115頁第91頁/共116頁顯微操作儀2第92頁/共115頁第92頁/共116頁細胞觀察與分析細胞計數與活力分析細胞固定與染色觀察凋亡細胞觀察染色體分析第93頁/共115頁第93頁/共116頁細胞計數與活力分析采用血細胞計數法計數活力分析：

臺盼藍染色法：死細胞著色MTT：活細胞使其還原為蘭色，用酶標儀測定490nm處的光密度，計算細胞相對活力第94頁/共115頁第94頁/共116頁血球計數板第95頁/共115頁第95頁/共116頁計數法第96頁/共115頁第96頁/共116頁細胞固定與染色觀察細胞固定甲醇-醋酸FAACarnoy細胞染色蘇木精-伊紅（H.E)染色法Giemsa染色法Feulgen染色法考馬斯藍染色法免疫熒光法免疫過氧化物酶染色法第97頁/共115頁第97頁/共116頁凋亡細胞觀察形態觀察:生化分析:錨定蛋白:檢測凋亡早期PI:檢測晚期或死細胞分子技術:梯形電泳圖譜第98頁/共115頁第98頁/共116頁形態觀察第99頁/共115頁第99頁/共116頁PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面第100頁/共115頁第100頁/共116頁FITC-AnnexinV染色第101頁/共115頁第101頁/共116頁FITC-AnnexinV和PI染色第102頁/共115頁第102頁/共116頁梯形電泳圖譜第103頁/共115頁第