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結核病的試驗室診斷主要內容結核病的流行情況1結核病的病原學32結核病的實驗室診斷3結核病的分子藥敏341.結核病的流行概況全球范圍內結核病疫情急劇惡化人口大規模流淌結核菌耐藥現象益發嚴峻結核病合并艾滋病感染我國是世界上僅低于印度的其次結核病大國結核菌感染率44.5%新發活動性結核患者130萬/年死亡13萬/年2011WHOtuberculosiscontrolreport我國是全球27個耐藥結核病高負擔國家之一2013年世界衛生組織宣布全球耐多藥結核病緊急狀態全球的結核病患者,在接受治療之前已經傳染給了別人!!!早期快速診斷與治療成為制約結核病限制的關鍵:有細菌學診斷依據的病人不超過50%當前結核探討的熱點新型抗結核藥物(50%)新型快速診斷技術(40%)新型結核疫苗(10%)7/45近期結核病診斷方法的相關探討JID2012:205(Suppl2),S147.2.結核病的病原學

結核分枝桿菌(M.tuberculosis)是引起人類結核病的主要病原體。1882年由德國醫生Koch發覺。結核分枝桿菌屬于厚壁門、裂殖菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。分枝桿菌復合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型,而人型結核分枝桿菌是人類主要的致病菌。2023/3/5GDTB8結核分枝桿菌(M.tuberculosis)生物學主要特點:1.細胞壁中含有大量脂質2.引起的疾病都呈慢性,并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性生長特點:生長緩慢,繁殖一代在人工培育基內約須要15~20小時,在靜脈感染未經免疫小鼠肺中約須要15小時,在巨噬細胞內約須要15~20小時,在家兔角膜中約須要20~22小時。試驗室檢查方法的歷史1880s Tuberclebacilli的發覺 Ziehl-Neelsen染色方法1900s Mantouxtest(TSTwithtuberculin)1920s Petragnanimedium PurifiedProteinDerivative(PPD)1930s Lewenstein-Jensen培育基1940s Dubosagar,Ogawa培育基1950s Middlebrook7H91990s NAAT2000s ELISPOT,QuantiFERON,2010s LPA,GeneXpert2020s???3.結核病的試驗室診斷細菌學涂片:敏感性低傳統固體培育:所需時間長,2~3月分子生物學TB-DNATB-mRNA血清/免疫學IGRA:有望替代TST,但不能區分活動性TB與潛藏感染血清學:存在抗原純度和特異性差等方面的問題液體培育及藥敏試驗:平均時間20天①.細菌學診斷萋尼氏染色熒光染色羅氏培育/藥敏試驗我國目前最常用的結核病試驗室診斷技術快培/藥敏試驗涂片?干燥?固定初染脫色復染顯微鏡檢查登記/報告顯微鏡檢查堿性復紅鹽酸酒精亞甲蘭石炭酸金胺O鹽酸酒精高錳酸鉀光學顯微鏡檢查熒光顯微鏡檢查萋尼氏染色鏡下形態熒光染色鏡下形態LEDFluorescencemicroscopy

LED熒光顯微鏡LED熒光顯微鏡成本低廉的超亮發光二極管可承受的價格,價格接近于現有的光學顯微鏡壽命長(~15-20,000小時)省電可用電池供能牢靠性更強不須要空調設施不須要暗室診斷性能優于標準熒光顯微鏡操作人員工作負荷減輕一般熒光顯微鏡和發光二極管熒光顯微鏡性能比較(不同試驗室的結果進行匯總與平均)顯微鏡方法靈敏度(%)特異度(%)普通熒光顯微鏡直接涂片67.496.1普通熒光顯微鏡濃集涂片66.699.2發光二極管熒光顯微鏡直接涂片71.6(p=0.1025)96.4發光二極管熒光顯微鏡濃集涂片72.4(p=0.0073)98.8

Bactec?MGIT960/320Bact/Alert3DVERSATREK生產廠家美國BD公司法國生物梅里埃公司美國Trek診斷公司儀器定位專業分枝桿菌檢測系統業內金標準普通細菌血培養系統需加裝分枝桿菌培養特殊組件普通細菌血培養系統需加裝分枝桿菌培養特殊組件單機容量960個檢測位每年可至少檢測8000個樣本240個瓶位每年可檢測2000個樣本528個瓶位日均標本處理量25~30個6~7個9個檢測原理熒光增強法:采用敏感性較強的熒光信號探測氧氣的變化情況,只需單一反應,所以速度快,準確性高PH值比色法:當培養瓶內有微生物生長,其釋放出的CO2,經水飽和后,產生H+,使PH值產生變化,感應器的顏色也隨之變化。需雙重反應,因此速度較慢,假陽性率較高,此技術已趨向淘汰壓力檢測:檢測細菌生長中各種氣體產生和消耗而引起的瓶內壓力的變化。靈敏度差。此技術已趨向淘汰檢測技術瓶外檢測技術瓶外檢測技術瓶內檢測技術易導致污染及生物安全問題平均陽性報告時間8-11天15-21天不詳藥敏試劑5種一線抗TB藥物,全部具有FDA及SFDA認證無藥敏試劑提供只有3種一線藥物培育/藥敏試驗陰性培育陽性培育無或微弱熒光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2強熒光傳感器對氧氣高度敏感的釕復合物肉湯改良Middlebrook7H9肉湯上部空間已預先充填10%CO2BACTEC?MGIT?960/320

指示器系統MGIT/3D制造的液體培育基優點比固體培育快(平均10-12天vs.20-24天)比固體培育基更敏感可以自動判讀,或運用標準指示管和操作手冊進行判讀也加快了藥敏試驗的速度局限須要NALC-NaOH進行痰處理和離心一般菌群的污染很常見比固體培育更常常地檢出非結核分枝桿菌(常常不致病)確定診斷前必需對全部的陽性培育物進行結核分枝桿菌的鑒定比固體培育基昂貴②血清學診斷血清學診斷技術優勢:是一種對疾病進行早期診斷的志向方法。無需活細胞培育和特殊儀器設備操作簡便結果顯示快速目前用于血清學診斷的主要方法:酶聯免疫吸附試驗(ELlSA)斑點金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(WesternBlotting)等等WHO對來自不同國家的19種試劑盒產品進行評估,結果表明:與痰培育相比,這些試劑盒檢測的靈敏度為1%~60%,特異度為53~99%1。緣由:由于所用的測定方法、運用的試劑種類或抗原、抗體的不同等,導致測定結果差異較大,并且缺乏可比性。WHO認為現有的血清學診斷試劑的敏感度和特異度都有待進一步提高,不舉薦其作為一種快速診斷的方法在臨床運用。1WHOWorldHealthOrganization.DiagnosisevaluationseriesNo.2:laboratory-basedevalutionof19commerciallyavailablerapiddiagnostictestsfortuberculosis.2008.WHO對結核抗體評估2011年WHO正式公告:由于目前的商業血清學試劑在結核檢測中存在較大差異,且檢測結果很高比例的假陽性和假陰性,因此不建議運用血清學方法作為結核桿菌的診斷試驗1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis.:///publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期診斷!簡潔漏診、誤診!血清學檢測的評價結核感染者體內存在特異的效應T淋巴細胞,效應T淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子(IFN-γ)。因此,檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛藏感染者的診斷。由于效應T細胞存活時間很短,而且具有特異性,因此可以作為機體是否正處于被感染的指標,無論是否有臨床癥狀。基于IGRA原理的產品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本土的結核診療指南中。目前應用的進口IGRA主要有兩種商品化的試劑:1)澳大利亞Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube(QFT-GIT)2)英國OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放試驗(IGRA)γ-干擾素釋放試驗(IGRA)γ

干擾素檢測陰性γ干擾素檢測陽性TB抗原多肽T細胞活化T細胞γ干擾素T-SPOT?.TB原理T-SPOT?.TB是以擁有專利的特異抗原(ESAT-6/CFP-10),通過酶聯免疫斑點技術(ELISPOT)檢測受試者體內是否存在結核效應T淋巴細胞,從而推斷目前該受試者是否感染結核桿菌(現癥感染)的新方法。結核桿菌特異抗原:早期分泌抗原靶6(EarlySecretedAntigenicRarget6,ESAT-6)培育濾液蛋白10(CultureFiltrateProtein10,CFP10)結核桿菌特異抗原由結核桿菌基因組RD1區相同的操縱子編碼的蛋白全部的卡介苗(BCG)均丟失該基因序列絕大多數的環境分枝桿菌也不存在RD1區ESAT-6與CFP-10抗原結核桿菌特異抗原蘇氏海堪薩斯戈登牛非洲T-SPOT?.TB臨床性能指標特異性只針對結核分枝桿菌復合群敏感,與絕大多數環境分枝桿菌和卡介苗(BCG)無交叉反應

美國FDA數據:特異性97.1%(297/306)國內臨床數據:特異性94.1%(478/508)靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響,在肺外結核患者中有很高的檢出率美國FDA數據:靈敏度95.6%(175/183)國內臨床數據:靈敏度95.3%(624/655)靈敏度ReferenceSensitivityJafarietal2006AJRCCM174;9:1048-53100.0%(12/12)FerraraetalLancet2006376;1328-34*83.3%(20/24)LeeetalEurRespirJ200628;24-30*96.6%(84/87)GolettietalClinMicrobiolInfect200612;6:544-50*91.3%(21/23)MeieretalEJCMID200524;529-53695.9%(70/73)KangetalChest.2007Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)JanssensetalERJ200730(4):722-898.3%(57/58)ClarkeetalClinExpImmunol2007150(2):238-44.90.0%(27/30)DetjenetalCID20071;45(3):322-8*92.9%(26/28)OzekincietalJIntMedRes2007;35:696-70392.9%(26/28)SoysaletalIJTLD200812(1):50-56*80.8%(80/99)DominguezetalClinVaccImmunol200815(1);168-71*85.7%(36/42)CheeetalJClinMicrobiol.2008Apr9*94.1%(254/270)VincentietalClinExpImmunol.2007Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)WangetalEmergingInfectDis200713;4:553-887.2%(34/39)LosietalEurRespirJ.2007Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)KimetalArchInternMed167;20:2255-2259100.0%(22/22)ConnelletalPLoSONE2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashietal.ScandJInfectDis2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashietal.JInfect.2008[Epubaheadofprint].*90.0%(36/40)Domínguezetal.DiagnMicrobiolInfectDis.2008.*[Epubaheadofprint]84.2%(32/38)Golettietal.PLoSONE.2008.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshardetal.RespirMed.2008.[Epubaheadofprint]98.4%(62/63)HiguchiMedMicrobiolImmunol.2008.[Epubaheadofprint]*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)特異性T-SPOT?.TB的試驗步驟用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血單個核細胞結核特異抗原(ESAT-6/CFP10)刺激結核特異的效應T淋巴細胞使其分泌γ-干擾素效應T淋巴細胞分泌的γ-干擾素與膜板預包被的抗γ-干擾素抗體結合并固定在細胞四周1個斑點=1個效應T細胞加入顯色液,視察結果過夜孵育,洗板,加入酶標二抗陰性結果陽性結果空白對照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對照(PHA)試驗效果圖方法學的優點檢測特異性的提高幫助臨床區分卡介苗接種和環境分枝桿菌感染引起的“假陽性”,避開了臨床的無效用藥檢測靈敏度的提高有利于臨床對結核病的早發覺、早治療,避開了疾病的傳播與擴散快速48小時出結果方法學的局限不能區分活動性TB與潛藏感染不能夠提示臨床患者的病變部位,須要結合臨床的推斷目前還不能夠依據斑點數量的多少來推斷患者是活動性結核病或是潛藏感染者檢測收費高(800元/次)試驗結果的說明陰性結果提示患者體內不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞。假陰性結果:①感染階段不同;②少數免疫系統功能不全/疾病;③試驗非正常操作。陽性結果提示患者體內存在針對結核桿菌特異的效應T細胞,患者存在結核感染。但是否是活動性結核病,需結合臨床癥狀和其它檢測指標綜合推斷。假陽性結果:①4種環境分枝桿菌感染時:M.kansasii(堪薩斯)、M.szulgai(蘇氏)、M.marinum(海)、M.gordonae(戈登)各國對潛藏感染風險人群的篩查指南風險人群美國指南加拿大指南英國指南免疫力抑制人群(例如,HIV感染者,使用強的松或TNF-α抑制劑治療)TST或IGRA;如果是陰性或高度懷疑的,TST和IGRA都要檢查TST,如果TST陰性要用IGRA確認TST或IGRABCG接種者(如果也屬于其它風險人群)推薦用IGRA沒有特定的推薦TST或IGRA與傳染性肺結核患者密切接觸TST或IGRATST,用IGRA進一步確認TST陽性TST,用IGRA進一步確認TST陽性醫務工作者TST或IGRA推薦用TSTTST或IGRA,視情況而定無法再來確認TST結果的人群(例如,流浪漢,注射吸毒者或交通不方便)推薦用IGRA沒有特定的推薦推薦用IGRA國外出生的人群只篩查過去5年內移民的人群;TST或者IGRA只篩查過去2年內小于15歲的移民;TST,用IGRA進一步確認TST陽性只篩查新移民;TST篩查5至15歲移民,用IGRA進一步確認TST陽性;IGRA篩查16至35歲移民其它風險人群TST或IGRATST,用IGRA進一步確認TST陽性TST,用IGRA進一步確認TST陽性樣本量為26680調查者的15個多中心探討顯示,在4年的隨訪中,IGRA-陽性的個體中發病數為4~48例/1000人/每年.2011年9月的探討結果提示,IGRA-陰性對于兒童(小于5歲)不能解除結核病(Pediatr.Infect.Dis.J.30,817–818,2011).ChildhoodtuberculosistreatmentremainsimprecisescienceNatureMedicineVolume:17,Page:116011October2011.TB-DNA檢測:1.能穩定檢測10copy的TB-DNA,靈敏度高,特異性強。2.早期、快速、精確地診斷結核病。痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結核血液——播散性結核和各臟器的結核病腦脊液——中樞神經系統結核病宮頸拭子、尿道拭子——泌尿生殖道結核病3.熒光定量PCR檢出結核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培育法。4.TB-DNA濃度可用于推斷療效:痰標本中結核桿菌的數量呈漸漸下降趨勢,TB-DNA拷貝數下降。依據病原體DNA濃度,對藥物治療及療效視察供應參考依據。③分子生物學診斷Real-timePCR環介導等溫擴增法(LAMP)的技術特點是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物,利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63-65℃)下保溫30-60分鐘,

即可完成核酸擴增反應。與常規PCR

相比,不須要模

板的熱變性、溫

度循環、電泳及

紫外視察等過程,

具有簡潔、快速、

特異性強的特點。環介導恒溫擴增(LAMP)技術2小時全過程目測法檢測流程檢測方法說明結果推斷在陰性比照反應管液體顏色呈橙色,陽性比照反應管液體顏色呈綠色的條件下:若待檢樣本反應管中液體顏色呈綠色,則可報告該樣本檢測結果為結核分枝桿菌陽性;若待檢樣本反應管中液體顏色呈橙色,則可報告該樣本檢測結果為結核分枝桿菌陰性;若陰陽性比照反應管結果與上述狀況不符,則本次檢測結果無效,應重新檢測。RNA作為臨床分子診斷靶標的優點:RNA拷貝數≥DNA拷貝數更具臨床意義:生命力旺盛的病原體RNA轉錄活躍RNA遠不如DNA穩定病原體死亡,RNA很快降解

1.交叉污染少

2.較好的愈后指標結核桿菌RNA(TB-RNA)SAT技術原理操作過程4.結核病的分子藥敏HAIN技術DNA?STRIP?T-spot

-XpertMTB/RIFDNA微陣芯片探針熔解曲線技術藥物藥物作用機制參與基因編碼酶作用突變頻率(%)INH氧自由基對DNA,脂質等多效應KatG觸酶-過氧化物酶活化原藥42~58INH對NADH競爭性INH-NADH加成物抑制分支菌酸合成代償katG功能inhAkasAahpCndhnatglf烯酰基載體蛋白還原酶酮酰基蛋白合成酶烷基氫過氧化物酶NADH脫氫酶芳香胺乙酰轉移酶吡喃半乳糖變位酶分支菌酸代謝靶酶靶酶?靶酶?NAD+減少乙酰化失活INH靶酶?21~3410~15耐藥標記物RFP抑制信使RNA轉錄rpoBRNA多聚酶靶酶96~100PZA酸化胞漿,失活酶活性抑制脂肪酸代謝?替代煙酰胺摻入NAD抑制膜轉運功能pncAFasI吡嗪酰胺酶FasI?活化原藥靶酶?72~97EMB阿拉伯半乳聚糖合成抑制阿拉伯呋喃糖累積脂阿拉伯甘露聚糖合成抑制embCABembB阿糖轉移酶靶酶47~65SM肽鏈翻譯錯誤rpsLrrs核糖體30S亞基S12蛋白核糖體16SrRNA靶位靶位52~598~21AK/KMOFx肽鏈翻譯錯誤抑制DNA回旋酶rrsgyrA核糖體16SrRNADNA回旋酶A亞基靶位靶酶75~94Cs抑制肽聚糖合成ulrA/dadBD-丙氨酸合成酶靶酶原理:接受線性探針技術(LiPA),擴增后的產物與預先固化在膜上的特異性探針雜交,通過顯色反應推斷結果。檢測標本:涂陽痰標本/TB-DNA陽性標本固體或液體培育菌株①Hain技術GT-Blot48自動雜交儀1臺所需設備:GTQPCR-96擴增儀1臺Mikro220離心機1臺恒溫器1臺超聲波振蕩儀1臺TARGET靶基因菌種鑒定16SrRNAIS6110異煙肼katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh利福平rpoB乙胺丁醇embB吡嗪酰胺pncA鏈霉素rpsL、rrs喹諾酮類藥物gyrA、gyrBMTBDRplus方法原理:PCR擴增檢測rpoB、katG和inhA基因突變位點,診斷RFP和INH耐藥。rpoB

野生型探針:WT1-WT8rpoB

耐藥突變探針:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→通過缺失的野生型信號進行突變探測→通過出現的突變信號進行突變探測MTBDRplus

rpoB511513516518522526531533rpoBWT2rpoBWT4rpoBWT6rpoBWT8rpoBWT7rpoBMUT1(D516V)rpoBMUT3(S531L)rpoBMUT2A(H526Y)rpoBMUT2B(H526D)514515rpoBWT1rpoBWT3rpoBWT5509508505MTBDRplus操作流程DNA提取用NALC/NaOH處理痰標本2)PCR擴增3)

雜交擴增產物和固化在膜上的特異性探針雜交4)

結果判讀MTBDRplus反應條帶(示范)BandeletteMTBDR?(HainLifescience)

鑒定結核菌利福平rpoBINHkatG315藥物GenoTypeMTBDRplus結果比例法藥敏結果

耐藥

敏感INH

耐藥450

敏感716靈敏度:86.5%(45/52)特異度:100%(16/16)符合率:89.7%(61/68)菌株標本GenoTypeMTBDRplus方法與比例法藥敏試驗結果比較藥物GenoTypeMTBDRplus結果比例法藥敏結果

耐藥

敏感RFP耐藥480

敏感116靈敏度:98.0%(48/49)特異度:100%(16/16)符合率:98.5%(64/65)菌株標本GenoTypeMTBDRplus方法與比例法藥敏試驗結果比較痰標本(涂片陽性)GenoTypeMTBDRplus方法與比例法藥敏試驗結果比較藥物GenoTypeMTBDRplus結果比例法藥敏結果

耐藥

敏感INH

耐藥630

敏感1129靈敏度:98.4%(63/64)特異度:100%(129/129)符合率:99.5%(192/193)痰標本(涂片陽性)GenoTypeMTBDRplus方法與比例法藥敏試驗結果比較藥物GenoTypeMTBDRplus結果比例法藥敏結果

耐藥

敏感RFP

耐藥3912

敏感2140靈敏度:95.1%(39/41)特異度:92.1%(140/152)符合率:92.7%(179/193)優點:Hain技術可以快速檢測RFP和INH的耐藥時間短、操作簡潔、平安高特異性和靈敏度較高、重復性好主觀因素影響小、更為牢靠缺點:須要特地設備;未發覺全部的耐藥突變位點,不能檢測全部藥物的耐藥基因型;MTBDRplus試劑盒的檢測試紙條,缺少ahpC-oxyR間隔序列范圍,否則可進一步提高INH耐藥檢測的敏感性;不能取代傳統細菌學檢測、只能作為參考。進行標本處理、實時PCR和利福平耐藥性檢測的完整平臺此平臺由FIND和Cepheid(一個加州公司)所開發痰標本可以干脆放

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