-.z.沙門氏菌的檢驗(yàn)食品學(xué)院14食品質(zhì)量與安全1班*文敏柳基煒衛(wèi)杰恒溫紫君5612摘要：本實(shí)驗(yàn)采用GB/T4789.4-2010的檢測(cè)方法測(cè)定雞場(chǎng)中的沙門氏菌。通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)沙門氏菌的檢測(cè)方法和技術(shù)，了解沙門氏菌的一些生化特性；本實(shí)驗(yàn)先用顯色培養(yǎng)基找出可疑菌落，再做生化試驗(yàn)找出可疑的典型性的沙門氏菌，再通過血清學(xué)試驗(yàn)最終確定是否為沙門氏菌屬。關(guān)鍵詞：沙門氏菌接種生化試驗(yàn)血清學(xué)鑒定前言沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)中具有重要意義的人畜共患病種之一，其病原沙門氏菌屬于腸道細(xì)菌科。沙門氏菌是一個(gè)統(tǒng)稱，泛指2000多種有緊密連系的細(xì)菌，包括引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。雖然只有少數(shù)人因沙門氏菌而患病，但是，在世界*圍內(nèi)的細(xì)菌性食物中毒事件中，由沙門氏菌引起的占大多數(shù)。因此，采用科學(xué)、合理的方法檢驗(yàn)食品中沙門氏菌，已經(jīng)成為了人們最關(guān)心的問題之一[1]。國標(biāo)法(GB4789.4-2010)是目前中國規(guī)定的食品中沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法,也是基層實(shí)驗(yàn)室普遍采用的檢測(cè)方法,它根據(jù)沙門氏菌的生長特點(diǎn)和生化特性,采取前增菌、增菌、分離、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定5個(gè)步驟進(jìn)行[2]。材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1儀器設(shè)備均質(zhì)器、三角燒瓶、平皿、玻璃棒、接種棒恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，42℃±1℃吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸頭電子天平PL602-S，梅特勒-托利多儀器（）；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋SYQ-DS*-280B，**申安醫(yī)療器械廠1.1.2試劑藥品雞腸、靛基質(zhì)試劑、沙門氏菌O和H診斷血清、API20E生化試劑盒或VITEKGNI生化鑒定卡1.1.3培養(yǎng)基蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、HE瓊脂、三糖鐵瓊脂、蛋白胨水、尿素瓊脂、氰化鉀、氰化鉀對(duì)照、賴氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶對(duì)照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培養(yǎng)基1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1培養(yǎng)基的制備1.2.1.1培養(yǎng)基的配制步驟蛋白胨水（BPW）：稱取蛋白胨10g、氯化鈉5g、磷酸氫二鈉9g、磷酸二氫鈉1.5g、蒸餾水1000ml，將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10min，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，高壓滅菌121℃，15min。分裝10瓶，每瓶90ml四硫磺酸鈉煌綠（TTB）：高壓滅菌121℃，15min滅菌冷卻后至30℃，每100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液加碘液2ml，煌綠液1ml1.2.1.2配制培養(yǎng)基的注意事項(xiàng)（1)按照說明書上的用量進(jìn)行換算，稱取準(zhǔn)確分量的合成培養(yǎng)基粉末；（2）加熱煮沸溶解培養(yǎng)基時(shí)，留意鍋內(nèi)水位的變化，水位下降可再添加適量的水，以免水分蒸發(fā)過多，導(dǎo)致后面分裝不夠量；（3）往試管中放小導(dǎo)管時(shí)，注意處理氣泡。1.2.2沙門氏菌群檢測(cè)1.2.2.1沙門氏菌檢測(cè)程序沙門氏菌檢測(cè)操作步驟2.1前增菌稱取10g（mL）樣品放入盛有90mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置于盛有90mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。2.2増菌輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。2.3分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)HE瓊脂平板。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個(gè)平板上生長的菌落,各個(gè)平板上的菌落特征見表12.4生化試驗(yàn)2.4.1三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表2。在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，同時(shí)賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性的菌株可以排除。其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌屬的可能，同時(shí)也均有不是沙門氏菌屬的可能。2.4.2系列生化反應(yīng)試驗(yàn)接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí),可直接接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（K）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長至48h，按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時(shí)復(fù)查。2.4.3反應(yīng)序號(hào)A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、K和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表4可判定為沙門氏菌，如有2項(xiàng)異常為非沙門氏菌。反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。2.4.5反應(yīng)序號(hào)A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。2.4.6必要時(shí)按表5進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。2.5血清學(xué)鑒定滴一定生理鹽水在載玻片靠近磨砂的一邊作對(duì)照，在另外一邊滴一滴血清，用滅菌后的接種環(huán)從三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面取一點(diǎn)菌種，放進(jìn)血清中，然后用酒精燈將接種環(huán)滅菌冷卻后，再取少量菌種放進(jìn)生理鹽水中。觀察血清中的的菌落是否凝結(jié)，與生理鹽水中的菌落對(duì)比。2.6結(jié)果與報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1.1沙門氏菌檢測(cè)現(xiàn)象和結(jié)果（見表7）表7沙門氏菌檢測(cè)現(xiàn)象和結(jié)果試劑硫化氫蛋白胨（加靛基質(zhì)）尿素氰化鉀賴氨酸脫羧酶現(xiàn)象黑色不變色桃紅色不渾濁綠色結(jié)果+-+-+注：+陽性，-陰性3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析對(duì)照沙門氏菌生化反應(yīng)初步鑒定表，尿素，氰化鉀，賴氨酸脫羧酸三項(xiàng)中有兩項(xiàng)異常，按沙門氏菌生化鑒定表可判定結(jié)果為非沙門氏菌屬。3.1.3甘露醇和山梨醇試驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果甘露醇和山梨醇都變成黃色，表現(xiàn)為陽性。需要補(bǔ)做血清學(xué)鑒定試驗(yàn)。3.1.4OPNG試驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果OPNG變成深黃色，表現(xiàn)為陽性，為非沙門氏菌屬。3.2.1血清學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果血清中的菌落沒有出現(xiàn)凝結(jié)現(xiàn)象，與生理鹽水中的菌落現(xiàn)象一樣。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析血清學(xué)鑒定結(jié)果為該菌落為非沙門氏菌屬。4實(shí)驗(yàn)結(jié)論與討論結(jié)論：綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果，25g樣品中未檢出沙門氏菌屬。討論：沙門氏菌是重要的腸道致病菌，腸炎沙門氏菌是其中的一種，常引起雞、鴨等禽類感染，還可引起食物中毒［5］，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為非沙門氏菌屬，可見實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性可信性不高，實(shí)驗(yàn)過程中可能存在操作失誤（如接種環(huán)還未冷卻就取種，導(dǎo)致菌種死亡）或者其他原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)偏差，應(yīng)該重新做實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照國標(biāo)再次進(jìn)行試驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可信度。鑒于雞肉等畜禽產(chǎn)品污染沙門氏菌所引起食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，越來越多的學(xué)者投入到其生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的溯源研究中。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法由于存在著抗原的變異及不同種屬菌間的交叉反應(yīng)等，其應(yīng)用受到了一定限制[3]。而ERIC-PCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)，靈敏度高、鑒別能力強(qiáng)、所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為細(xì)菌基因分型、流行病學(xué)調(diào)查研究領(lǐng)域里強(qiáng)有力的工具［4］。.5檢驗(yàn)報(bào)告報(bào)告陰性結(jié)果：25g樣品中未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌。參考文獻(xiàn)[1]陳玲.食品中沙門氏菌檢驗(yàn)方法的研究[J].科技與創(chuàng)新，2015,8.[2]孫園園，趙鵬等.沙門氏菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，