廈門大學有機化學實驗實驗十一亞甲基藍與熒光黃的分離第1頁/共14頁二實驗原理

色譜法亦稱色層法、層析法等，是分離、純化和鑒定有機化合物的重要方法之一。色譜法的基本原理是利用混合物各組分在某一物質中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他親和作用性能的差異，混合物的溶液流經該種物質，進行反復的吸附或分配等作用，從而將各組分分開。第2頁/共14頁

色譜分離法葉綠素的石油醚溶液石油醚1903年俄國植物學家M.G.茨維特

CaCO3

色譜法最初源于對有色物質的分離，后來隨著各種顯色、鑒定技術的發展，其應用范圍早已擴展到無色物質。二實驗原理第3頁/共14頁氣相色譜液相色譜柱色譜薄層色譜固定相：液體、固體紙色譜流動相：氣體、液體、超臨界流體色譜分離法的分類

（按操作條件的不同）第4頁/共14頁吸附色譜排阻色譜（凝膠色譜）分配色譜離子交換色譜吸附能力的差異分子尺寸的大小不同兩相中分配系數的不同親和力的差異AdsorptionchromatographyExclusionchromatographyGel-permeationchromatographyPartitionchromatographyIon-exchangechromatography親和色譜特異性親和力Affinitychromatography

色譜分離法的分類

（按組分在固定相中的作用原理不同）第5頁/共14頁

色譜法具有樣品用量少、分離效能好、分析速度快、檢測靈敏度高、適用范圍廣和操作簡便等特點。在有機化學中的應用主要包括以下幾個方面：1、分離混合物2、精致提純化合物3、利用比移值（Rf）鑒定化合物4、跟蹤反應進程色譜法的應用第6頁/共14頁

由于不同化合物吸附能力不同，因而在洗脫時以不同的速度沿柱向下流動，吸附能力弱的組分隨溶劑首先流出。在連續洗脫過程中，不同組分或不同色帶就能分別收集，從而達到分離純化的目的。柱色譜第7頁/共14頁柱色譜1吸附劑

常用的吸附劑：氧化鋁，硅膠，氧化鎂，碳酸鈣，活性炭或纖維素粉。

選擇吸附劑的首要條件：不與被分離物或展開劑發生化學反應。

吸附能力與以下幾點有關：（1）吸附劑顆粒大小（100～150目）（2）吸附劑含水量（6％～10％，II～III級）第8頁/共14頁柱色譜2溶劑

通常根據被分離物中各組分的極性、溶解度和吸附活性等來考慮。先將帶分離的樣品溶于盡量少的非極性溶劑中，從柱頂流入柱中，依次增大溶劑的極性，將不同化合物依次洗脫（梯度洗脫）。石油醚＜環己烷＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水＜乙酸常用洗脫劑的極性：第9頁/共14頁1、取一支色譜柱，在柱子的收縮部塞一小團脫脂棉花，注意松緊要適度。然后在棉花上鋪一層粗硅膠或石英砂。2、將色譜柱垂直固定在鐵架臺上，往柱內加適量70%乙醇溶液，打開活塞，趕走氣泡！3、再向柱中倒入適量70%乙醇溶液，打開活塞，控制滴速為1滴／秒，用小錐型瓶承接，同時通過漏斗慢慢裝入5gAl2O3，使其逐漸沉入底部。三實驗步驟及注意事項第10頁/共14頁4、加完吸附劑后，在吸附劑上再蓋一張直徑大小合適的小濾紙。5、當溶劑的液面剛好流至濾紙面時關閉二通活塞，立即用移液管加入1mL亞甲基藍和熒光黃的乙醇混合液，盡量避免待分離混合液粘附在柱的內壁上。6、打開二通活塞，等柱內的溶劑恰好流到濾紙面時，關閉二通活塞，向柱內加入70%乙醇，打開二通活塞進行洗脫。三、實驗步驟及注意事項第11頁/共14頁7、用錐形瓶收集藍色的亞甲基藍溶液。【洗脫時切勿使溶劑流干】8、當藍色溶液收集完后，等柱內的70%乙醇溶液恰好流到濾紙面時，關閉二通活塞，加入適量2%氨水作為洗脫劑。打開二通活塞收集黃綠色的熒光黃溶液，直到其完全被洗出。三、實驗步驟及注意事項第12頁/共14頁三實驗步驟及注意事項9、用量筒分別量取所分離出來的亞甲基藍和熒光黃溶液的體積后，倒入指定的回收瓶中。10、分離結束后，應先讓溶劑盡