探究變?nèi)~海棠物種界定和居群遺傳分化模式,園藝學(xué)論文物種復(fù)合體〔speciescomplex〕是指通過雜交和多倍化產(chǎn)生的親緣關(guān)系復(fù)雜、遺傳分化很小的多類群復(fù)雜物種系統(tǒng)〔Kochetal.，2003；Loetal.，2018；Durkovicetal.，2020〕。變?nèi)~海棠物種復(fù)合體〔Malustoringoidesspeciescomplex〕是蘋果屬野生資源中變異式樣和種間關(guān)系很復(fù)雜的一個復(fù)合體，由變?nèi)~海棠、花葉海棠、隴東海棠、多毛海棠、馬爾康海棠和小金海棠6個物種組成〔成明昊等，2000，2002，2003；石勝友等，2004〕。AFLP標(biāo)記分析和多拷貝核基因ITS序列變異支持變?nèi)~海棠是花葉海棠和隴東海棠雜交后代的觀點〔石勝友等，2005；Fengetal.，2007〕；通過具體的野生資源調(diào)查研究，另外3個與變?nèi)~海棠近緣的類群被界定為物種并歸入變?nèi)~海棠物種復(fù)合體。華而不實馬爾康海棠的花、葉和果實等分類學(xué)性狀介于變?nèi)~海棠和隴東海棠之間，而多毛海棠的性狀則介于變?nèi)~海棠和花葉海棠之間〔成明昊等，2002，2003；鄧洪平等，2002〕。小金海棠的葉片和花部性狀與隴東海棠近似，而核型與四倍體變?nèi)~海棠類似〔梁國魯和李曉林，1993；成明昊等，2000〕。在地理分布上，變?nèi)~海棠物種復(fù)合體當(dāng)前界定的6個物種在四川西部山區(qū)呈同域分布〔成明昊等，1999〕。上述證據(jù)顯示這些物種相互具有非常嚴(yán)密的親緣關(guān)系。前人的研究不僅豐富了對野生蘋果資源的認(rèn)識，也在一定程度上揭示了變?nèi)~海棠物種復(fù)合體中物種的遺傳來源〔鄧洪平等，2002；石勝友等，2004〕。與多拷貝核基因〔如ITS序列〕相比，單拷貝核基因用于野生果樹資源的研究具有如下優(yōu)勢。首先，避免了致同進(jìn)化〔concertedevolution〕導(dǎo)致的序列均一化，雜種中兩個親本所特有的核苷酸變異能夠完好保存下來，有助于雜種的辨別和雜交親本確實定〔Sang，2002〕。其次，單拷貝核基因基本不受基因重復(fù)的影響，能夠很好地反映物種真實的進(jìn)化關(guān)系〔Zouetal.，2008〕。單拷貝核基因已經(jīng)成功應(yīng)用在作物資源遺傳關(guān)系的研究上〔Geetal.，1999；Doyleetal.，2004；Brassacetal.，2020〕。使用編碼淀粉分支酶的單拷貝核基因SbeⅠ探究變?nèi)~海棠物種復(fù)合體中6個物種的遺傳關(guān)系。SbeⅠ基因分析進(jìn)一步證實變?nèi)~海棠源于雜交，花葉海棠是雜交親本之一，但是排除隴東海棠介入了變?nèi)~海棠的雜種起源。同時SbeⅠ分析顯示多毛海棠與變?nèi)~海棠，以及馬爾康海棠與小金海棠具有一樣的遺傳組成，并且后兩者是變?nèi)~海棠與隴東海棠進(jìn)一步雜交產(chǎn)生的后代〔Tangetal.，2020〕。物種分類界定不僅僅是分類學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究的重要問題〔DeQueiroz，2007；Fujitaetal.，2020〕，也是野生資源鑒定、評價、利用和保衛(wèi)研究中需要首先解決的基本問題。變?nèi)~海棠物種復(fù)合體中的類群能否界定為6個獨立的物種？假如不能全部界定為物種，哪些需要歸并？至今沒有得到解決。本研究在說明變?nèi)~海棠物種復(fù)合體類群遺傳來源的基礎(chǔ)上，通過單拷貝核基因SbeⅠ探究其物種界定和居群遺傳分化形式，確定復(fù)合體類群的分子分化水平，并說明類群的分類學(xué)地位，以期為蘋果屬野生資源的鑒定、利用和保衛(wèi)提供指導(dǎo)和科學(xué)根據(jù)。1、材料與方式方法1.1變?nèi)~海棠物種復(fù)合體物種取樣2018年6月在四川省阿壩藏族羌族自治州的阿壩縣、馬爾康縣和小金縣采集變?nèi)~海棠物種復(fù)合體居群樣品〔表1〕。一共采集了不同地點的10個自然居群的葉片材料，每個居群隨機挑選2~6個個體，不同個體間隔30m以上，葉片材料經(jīng)硅膠枯燥后帶回西南大學(xué)，保存在20℃冰箱中備用。變?nèi)~海棠物種復(fù)合體除花葉海棠和隴東海棠外，其余均為無融合生殖類群，同一類群僅由一種基因型構(gòu)成〔Tangetal.，2020〕，因而現(xiàn)有居群取樣基本能代表整個變?nèi)~海棠物種復(fù)合體。1.2PCR擴增、克隆和測序采用CTAB法〔DoyleDoyle，1987〕提取葉片總DNA，稀釋至適宜濃度。SbeⅠ基因的引物根據(jù)栽培蘋果的SbeⅠ基因外顯子序列設(shè)計，上、下游引物分別為M1014F〔5ATAGTGAGCAGCACAAATG3〕和M1014R〔5TGCCTCCTCACTTTCAT3〕。PCR反響體系為25?L，包括2.5?L10ExTaq緩沖液，10~50ng的基因組DNA，2.0mmol?L-1的MgCl2，0.2mmol?L-1的每種dNTP，0.1?mol?L-1的上下游引物，1.0U的ExTaq酶。擴增程序：94℃預(yù)變性1min，然后94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，純化回收之后克隆至質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌。每個樣品挑選8~16個陽性克隆，提取質(zhì)粒后送英駿公司〔重慶〕的ABI3730測序儀測序。1.3物種界定分析SbeⅠ核苷酸序列的多序列比對由ClustalX軟件〔Thompsonetal.，1997〕在默認(rèn)參數(shù)設(shè)置下進(jìn)行，然后手工調(diào)整同源性排列不恰當(dāng)?shù)牟糠帧CR擴增經(jīng)過中產(chǎn)生的重組序列由RDP3軟件〔Martinetal.，2018〕辨別并去除。挑選代表性SbeⅠ序列用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。根據(jù)Modeltest3.7的AIC優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)〔PosadaCrandall，1998〕確定SbeⅠ最優(yōu)核苷酸替換模型，然后使用PHYML軟件〔Guindonetal.，2018〕構(gòu)建SbeⅠ最大似然進(jìn)化樹，進(jìn)化樹拓?fù)錁?gòu)造的可靠性通過100次自展〔bootstrap〕檢驗進(jìn)行評價。我們使用GSI指數(shù)genealogicalsortinginde〔xCummingsetal.，2008〕和PTP模型Poissontreeprocesses〔Zhangetal.，2020〕在兩個進(jìn)化等級上進(jìn)行物種界定分析。一是將SbeⅠ的整個最大似然進(jìn)化樹用于物種界定，同時也對進(jìn)化樹的3個進(jìn)化枝逐一進(jìn)行物種界定分析。為了考慮拓?fù)錁?gòu)造估計中存在的不確定性，利用100次自展檢驗得到的進(jìn)化樹構(gòu)建主要規(guī)則一致樹，將其用于物種界定分析。所有的界定分析均通過在線分析工具〔GSI指數(shù)〕和PTP模型〕完成。1.4居群遺傳學(xué)分析對于3個進(jìn)化枝以及進(jìn)化枝的每個類群，使用DNASP程序〔LibradoRozas，2018〕計算SbeⅠ基因的核苷酸多樣性，指標(biāo)包括分離位點個數(shù)、單倍型個數(shù)及其多樣性、核苷酸多樣性〔和兩種度量指標(biāo)〕。變?nèi)~海棠物種復(fù)合體分類群間的成對固定指數(shù)Fst也通過DNASP程序計算。采用MEGA5.10程序〔Tamuraetal.，2018〕計算不同類群的成對遺傳距離，同時也計算同一類群內(nèi)部的遺傳距離。另外，計算任意兩條序列之間的遺傳距離。遺傳距離根據(jù)MEGA5.10程序的Kimura雙參數(shù)模型〔Kimura，1980〕進(jìn)行度量。2、結(jié)果與分析2.1序列特征共獲得了變?nèi)~海棠物種復(fù)合體的代表性SbeⅠ基因序列82條，通太多序列比對，經(jīng)手工調(diào)整后長983bp，包含SbeⅠ外顯子11~17之間的核苷酸序列。SbeⅠ序列包含變異位點26個，華而不實簡約信息位點22個，絕大部分變異位點分布在內(nèi)含子區(qū)域。2.2變?nèi)~海棠物種復(fù)合體物種界定結(jié)果Modeltest3.7確定最合適變?nèi)~海棠物種復(fù)合體SbeⅠ基因的核苷酸替換模型為HKY+I。基于HKY+I模型使用PHYML構(gòu)建了SbeⅠ基因的最大似然進(jìn)化樹，結(jié)果如此圖1所示。變?nèi)~海棠物種復(fù)合體的SbeⅠ被分為3個大的進(jìn)化枝〔Clade1~3〕，每個進(jìn)化枝作為單系得到了很好的支持，但是進(jìn)化枝內(nèi)部的分歧關(guān)系基本沒有自展支持。進(jìn)化枝1包含變?nèi)~海棠、多毛海棠、馬爾康海棠和小金海棠4個分類群；進(jìn)化枝2由進(jìn)化枝1的4個分類群再加花葉海棠構(gòu)成；進(jìn)化枝3由隴東海棠、馬爾康海棠和小金海棠組成〔表1〕。SbeⅠ基因最大似然分析結(jié)果與變?nèi)~海棠物種復(fù)合體遺傳來源研究結(jié)果Tang等〔2020〕的一致。使用SbeⅠ基因的整個拓?fù)錁?gòu)造進(jìn)行物種界定分析，GSI指數(shù)分析顯示每個進(jìn)化枝的GSI指數(shù)接近或者等于1，表示清楚這3個進(jìn)化枝能夠清楚明晰地界定為物種，并且P值在0.01水平上顯著〔表2〕。PTP模型分析的結(jié)果和GSI指數(shù)的一樣。為了進(jìn)一步討論組成進(jìn)化枝的不同類群能否能夠界定為獨立的物種，對每個進(jìn)化枝逐一進(jìn)行了GSI指數(shù)和PTP模型分析。GSI指數(shù)分析的結(jié)果見表2，組成進(jìn)化枝1的4個類群的GSI指數(shù)均為0，對應(yīng)的P值全為1，顯示進(jìn)化枝1的4個類群不能被界定為物種。組成進(jìn)化枝2的5個類群中，僅花葉海棠GSI指數(shù)的P值在0.01的水平顯著，其他4個類群GSI指數(shù)的P值均不顯著，表示清楚這4個類群在進(jìn)化枝2上仍然不能界定為物種。進(jìn)化枝3的GSI指數(shù)分析顯示其所包含的3個類群也都不能被界定為物種。固然隴東海棠GSI指數(shù)的P值不顯著，但是GSI指數(shù)值相對較大，表示清楚隴東海棠SbeⅠ基因譜系會聚的程度比馬爾康海棠和小金海棠的高。PTP模型分析與GSI指數(shù)的物種界定結(jié)果基本一致，進(jìn)化枝中的每個類群作為物種均未得到支持。2.3變?nèi)~海棠物種復(fù)合體的遺傳多樣性和遺傳分化TajimasD檢驗表示清楚SbeⅠ基因在變?nèi)~海棠物種復(fù)合體分歧經(jīng)過中沒有偏離中性進(jìn)化形式〔表3〕。由于進(jìn)化枝之間的遺傳分化較大，因而以進(jìn)化枝以及進(jìn)化枝包含的分類群為單位計算遺傳多樣性，結(jié)果見表3。以進(jìn)化枝為單位，遺傳多樣性由低到高的順序是：進(jìn)化枝1進(jìn)化枝3進(jìn)化枝2。以分類群為單位，多毛海棠的遺傳多樣性〔〕大約是變?nèi)~海棠的2.5倍。馬爾康海棠和小金海棠的遺傳多樣性與其所處的進(jìn)化枝有關(guān)。進(jìn)化枝1中兩者均無變異，進(jìn)化枝2中馬爾康海棠的多樣性高于小金海棠，而進(jìn)化枝3中則是小金海棠的多樣性高于馬爾康海棠。采用遺傳距離和固定指數(shù)Fst兩個指標(biāo)度量類群間的遺傳分化，結(jié)果見表4。不同進(jìn)化枝類群間的成對遺傳距離基本上都大于0.01，而同一進(jìn)化枝的不同類群的成對遺傳距離大多在0~