利用基因芯片分析孕婦外周血漿APC基因甲基化的初步研究【摘要】

目的

研究孕婦外周血漿中APC基因甲基化模式與孕婦妊娠狀態(tài)的關(guān)系，探討其應(yīng)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的可行性。辦法

從不同妊娠時(shí)期孕婦和健康未孕婦女外周血漿標(biāo)本中提取APC基因，經(jīng)過亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后，利用基因芯片辦法檢測(cè)分析APC基因啟動(dòng)區(qū)一組CpG位點(diǎn)的甲基化模式，并對(duì)不同妊娠時(shí)期以及健康未孕樣品進(jìn)行了分析比擬。結(jié)果

健康未孕婦女血漿中APC基因是未甲基化或低甲基化的，而在妊娠狀態(tài)下是高甲基化狀態(tài)的，但不同妊娠時(shí)期甲基化程度有所不同。結(jié)論

孕婦外周血漿APC甲基化模式的變化與妊娠狀態(tài)和時(shí)間均有一定的關(guān)系，基因芯片辦法可以高通量的檢測(cè)分析血漿DNA甲基化狀態(tài)。血漿DNA甲基化的分析進(jìn)一步應(yīng)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷具有可行性。

【關(guān)鍵詞】

無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷；DNA甲基化；基因芯片；APC基因

AmicroarraytoanalyzemethylationpatternoftheAPCgeneinmaternalplasmainpregnantwoman

【Abstract】

Objective

DetectionoftherelationshipbetweenmethylationpatternoftheAPCgeneinmaternalplasmainpregnantwomanandthestateofpregnancy，andestimationthepotentialitythatapplicatetononinvasiveprenataldiagnosis.Methods

PlasmaDNAwasisolatedfromperipheralbloodofpregnantwomen，thenafterbisulphate-treat，themethylationpatternofCpGsiteintheAPCpromoterwereanalyzedbyDNAmicroarray-basedmethod.ThemethylationpatternofdifferentialstagesinpregnantwomenandnonpregnantwomenwerecomparedbyDNAmicroarray.Results

ThemethylationpratternofCpGsiteintheAPCpromoterinhealthynonpregnantwomenaredenselymethylationandinpregnantwomenarehypomethylationorunmethylation.Thedegreeofmethylationinpregnantwomenaredistinction.Conclusion

TherearerelationshipbetweenthemethylationpatternoftheAPCgeneinmaternalplasmainpregnantwomenandthepatternofthedifferentialstagesandtimesofpregnancy.TheDNAmicroarraycanbeappliedasahighthroughputtooltomapmethylationpatternsinCpGislandsites.TheanalysisofDNAmethylationinplasmawillhavethepowerfulpotentialitythatapplicatetononinvasiveprenataldiagnosis.

【Keywords】

DNAmethylation;

noninvasiveprenataldiagnosis;genemicroarray;

APCgene

1997年，Lo等［1］首次報(bào)道在母體血循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了游離胎兒DNA，證實(shí)了母體血漿中的DNA是胎兒和母體DNA的混合體，這一發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷開辟了新的辦法。但以往對(duì)孕婦外周血中游離胎兒DNA的應(yīng)用大多局限在檢測(cè)胎兒從父親一方繼承來的基因或突變，且檢測(cè)的胎兒基因必須能與母親DNA序列顯著辨別開來。2022年，Poon等［2］利用后生性標(biāo)志，如胎兒與母體DNA甲基化的差別來辨別兩者，沖破了上述限制，這種表遺傳上的差別為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的思路。但是，對(duì)在妊娠與未孕婦女外周血漿中基因甲基化模式是否存在一定的關(guān)系，在不同妊娠期之間孕婦血漿中基因的甲基化模式是否存在一定關(guān)系等問題，目前還沒有報(bào)道。

正常妊娠時(shí)，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮蛻膜及其脈管系統(tǒng)，其發(fā)生在妊娠8～18周之間，侵入過程與癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移的時(shí)候有一些相似，因?yàn)榧?xì)胞必須通過基底層。先兆子癇的發(fā)病機(jī)制可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞在妊娠前3個(gè)月侵入子宮肌層失敗有關(guān)。Muller等［3］發(fā)現(xiàn)妊娠婦女和轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人在APC基因甲基化的改變上存在相似性。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇APC基因作為研究對(duì)象。

本實(shí)驗(yàn)以妊娠不同時(shí)期APC基因啟動(dòng)區(qū)不同CpG位點(diǎn)甲基化模式為根底，通過基因芯片對(duì)其變化規(guī)律進(jìn)行探索性研究，尋找出它們之間的差別，以期可以作為生理或疾病狀態(tài)的標(biāo)志物，并進(jìn)一步應(yīng)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。

1

資料與辦法

1.1

研究對(duì)象

從2022年5月～8月在東南大學(xué)從屬中大醫(yī)院婦產(chǎn)科進(jìn)行產(chǎn)前檢查的初孕婦中，隨機(jī)選擇82例作為研究對(duì)象，其中妊娠4～12周(早期)24例，13～27周(中期)24例，28～40周(晚期)24例，產(chǎn)后1周10例。年齡23～35歲，初孕，臨床無感染征象，無其他產(chǎn)科合并癥及并發(fā)癥。同時(shí)隨機(jī)選取未孕健康女性18例作為陰性對(duì)照組。

1.2

標(biāo)本收集和處理

對(duì)所有研究對(duì)象抽取5ml外周血EDTA抗凝。在24h內(nèi)，先1600g離心10min初步別離血漿，再于16000g下離心10min，充沛清除細(xì)胞碎片等，獲得純潔的血漿樣品，血漿DNA采用規(guī)范酚－氯仿辦法提取。

1.3

血漿DNA的亞硫酸轉(zhuǎn)化

取8μl的DNA加雙蒸水至20μl，加3M的NaOH2μl解鏈，42℃水浴15min。在每個(gè)樣品中參加5M的對(duì)苯二酚/亞硫酸氫鈉溶液360μl，50℃水箱孵育12～16h。DNA過柱純化(prgmaga公司)。將DNA轉(zhuǎn)移入新EP管中，參加3M的NaOH5μl，水浴15min。醋酸鈉、無水乙醇沉淀DNA。次日用30μl的TE重新溶解。

1.4

APC基因的不對(duì)稱PCR擴(kuò)增

APC基因上游引物5’-GGGGTTAGGGTTAGGTAGG-3’，下游引物5’-AACTACACCAATACAACCACATA-3’。PCR反饋體系：反饋體積25μl，包括10×PCRbuffer(有MgCl2)

2.5μl，10mmol/LCy3-dNTP2μl，10mmol/L上游引物0.5μl，10mmol/L下游引物2.5μl，模板DNA1μl，5u/μlTaq酶0.2μl，滅菌雙蒸水18.5μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃3min預(yù)變性，94℃30s變性，57℃30s退火，72℃40s延伸，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min，4℃保留。

1.5

基因芯片的制備

在潔凈的載玻片上，用2ml1.2%的瓊脂糖溶液均勻的平鋪在玻片外表，待其凝固后置于37℃烘干。使用前將其浸泡于0.1mol／L的NaIO4溶液中30min，再用蒸餾水洗片3次，每次5min，晾干后備用。在APC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)較多的區(qū)域設(shè)計(jì)了16個(gè)CpG位點(diǎn)(分布于5個(gè)探針)和一個(gè)陰性對(duì)照，6個(gè)探針點(diǎn)樣于膜片上。探針固定后備用。

1.6

芯片雜交

在各管中參加15μl的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和15μl的雜交緩沖液，置于95℃水浴鍋?zhàn)冃?min。將變性好的雜交液滴于玻片上的點(diǎn)樣區(qū)，并用18mm×18mm蓋玻片蓋于其上，然后避光置于37℃雜交2h，分別用2×SSC+0.2%SDS液、0.1%SSC+0.2%SDS液、0.1%SSC液洗滌共10min，室溫晾干后用ScanArray5000掃描儀掃描。

1.7

芯片掃描和結(jié)果判定

對(duì)芯片掃描得到Cy3圖像文件通過圈點(diǎn)確定雜交范圍，過濾背景噪聲，提取基因敘述的熒光信號(hào)強(qiáng)度值，用預(yù)先定的內(nèi)參照基因(植物基因)對(duì)Cy3的原始提取信號(hào)進(jìn)行均衡和修正；用stroppro2.0軟件分析Cy3熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。用下列3個(gè)條件作為判定基因陽性敘述的規(guī)范:(1)Cy3陽性點(diǎn)的熒光信號(hào)平均值超過陰性點(diǎn)信號(hào)的3倍，ratio比值范圍在2.7～3.3；(2)陰性熒光信號(hào)值400；(3)PCR結(jié)果良好。

1.8

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上雜交過程均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，數(shù)據(jù)以均值±規(guī)范差(x±s)表示。用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5分析軟件進(jìn)行方差分析和SNK法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比擬。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的顯著性設(shè)在P

[1]

[2]

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2

結(jié)果

2.1

血漿DNA的亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化

提取出的血漿DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉預(yù)處理后，非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此過程進(jìn)一步將模板上的尿嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶；而甲基化的胞嘧啶不受影響，保持不變。根據(jù)所選引物，APC的擴(kuò)增片段為178bp，見圖1。

1:健康

2：產(chǎn)后

3、4:早期

5、6:中期

7、8:晚期

M：marker

圖1

亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后APC基因

擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2

基因芯片的雜交結(jié)果

2.2.1

中期妊娠和健康未孕樣品中APC啟動(dòng)子區(qū)甲基化模式比擬

圖2中2與5顯示其芯片掃描結(jié)果，由圖中可見，在妊娠中期c、d探針上雜交點(diǎn)的信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)，在未孕婦女樣本中熒光強(qiáng)度值較弱，雜交掃描后s-median532值組間方差分析說明差別有顯著性(P

圖中a、b、c、d、e、f分別表示APC啟動(dòng)區(qū)不同CpG位點(diǎn)AP1、AP2、AP3、AP4、AP5的雜交結(jié)果，

1、2、3、4、5代表妊娠的早期、中期、晚期、產(chǎn)后1周、健康未孕五種妊娠狀態(tài)。

圖2

妊娠各時(shí)期芯片雜交結(jié)果

圖3

妊娠各期與健康未孕婦女APC啟動(dòng)

子區(qū)不同CpG位點(diǎn)熒光信號(hào)圖譜及分析

2.2.2

不同妊娠時(shí)期及未孕樣品中APC啟動(dòng)子區(qū)甲基化模式比擬

筆者進(jìn)一步對(duì)不同妊娠時(shí)期APC甲基化變化情況進(jìn)行了比擬，見圖2妊娠各時(shí)期芯片雜交結(jié)果及圖3妊娠各期與健康未孕婦女APC啟動(dòng)子區(qū)不同CpG位點(diǎn)熒光信號(hào)圖譜及分析。妊娠中期和晚期樣品檢測(cè)結(jié)果中APC基因的甲基化狀態(tài)有相似的模式，而在妊娠早期有較大的差別，雜交掃描后s-median532值SNK分析說明早、中、晚妊娠期b探針上差別有顯著性(PP>0.01)，表明其與健康樣品具有相似的甲基化模式。

3

討論

自Lo等首次報(bào)道母體血漿中的DNA是胎兒和母體DNA的嵌合物后。大多數(shù)研究者依靠外周血漿中胎兒特異性標(biāo)志物，已將胎兒DNA應(yīng)用于診斷性別和性連鎖疾病、Rh血型的鑒定、β-地中海貧血、父源性遺傳性疾病的診斷、非整倍體疾病的診斷、妊娠并發(fā)癥的篩選。另外，孕婦血漿中胎兒DNA含量的檢測(cè)也已在21-三體綜合征、驚厥、早產(chǎn)等一系列疾病中應(yīng)用。這些研究均說明了孕婦外周血漿DNA分析對(duì)于各種疾病產(chǎn)前診斷的潛在應(yīng)用價(jià)值。但以往對(duì)孕婦外周血中檢測(cè)的胎兒基因必須能與母親DNA序列顯著辨別開來，這種限制性的存在是由于母親血漿和血清中的胎兒DNA處于一種母體DNA背景過多的環(huán)境中。所以，當(dāng)前Y染色體上DNA的分析不能應(yīng)用于50％的女性胎兒。Poon等［2］等提出表遺傳在母血和胎兒中的不同為產(chǎn)前診斷提供了新的思路。Chim等［4］研究證明maspin基因啟動(dòng)子區(qū)在胎盤組織是低甲基化的，在孕婦外周血細(xì)胞是高甲基化的。同時(shí)，通過實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR，在妊娠的所有時(shí)期都檢測(cè)到了maspin基因序列，在分娩24h后被去除。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同妊娠時(shí)期以及健康未孕婦女外周血漿中APC基因甲基化模式的差別進(jìn)行了分析比擬，以期對(duì)所有的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。研究發(fā)現(xiàn)健康未孕婦女血漿中APC基因是未甲基化或低甲基化的，而在妊娠各時(shí)期均成高甲基化狀態(tài)，在不同時(shí)期甲基化程度有所不同。孕婦外周血漿中APC甲基化模式的變化與妊娠狀態(tài)和時(shí)間均有一定的關(guān)系，妊娠的不同時(shí)期，孕婦外周血漿中APC基因甲基化的模式有所不同。產(chǎn)后孕婦血漿DNA甲基化模式與健康未孕婦女的甲基化模式類似，且迅速消失［5］，這與遺傳標(biāo)志物DYS基因在妊娠時(shí)的變化具有相似性，從而表明孕婦外周血漿DNA甲基化模式的變化與妊娠時(shí)孕婦外周血中胎兒DNA的存在與含量有關(guān)。產(chǎn)后胎兒DNA迅速消失，而其甲基化狀態(tài)也隨之發(fā)生了改變。研究結(jié)果與前人研究相符。

Poon等利用甲基化特異性PCR、測(cè)序或引物延伸法來分析母親和胎兒之間DNA甲基化差別。但這些甲基化分析辦法僅僅能分析少量的已知基因，這大大延緩了甲基化的研究進(jìn)程。筆者選擇基因芯片辦法對(duì)孕婦血漿DNA的甲基化進(jìn)行了檢測(cè)，該技術(shù)能同時(shí)分析基因啟動(dòng)子上的多個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化模式。基因芯片上各位點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)弱所代表的甲基化模式及其規(guī)律性可以用來作為生理或病理狀態(tài)下的標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)健康婦女以及妊娠不同時(shí)期婦女的外周血漿DNA甲基化模式的檢測(cè)為甲基化在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用奠定了根底。DNA的甲基化可以作為一種新的產(chǎn)前診斷標(biāo)志，為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的進(jìn)一步開展提供了新的途徑。

【參考文獻(xiàn)】

1

LoYM，CorbettaN，ChamberlainPF，etal.PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum.Lancet，1997，350(9076):485-487.

2

Poon

LL，LeungTN，LauT