下呼吸道感染大腸埃希菌的檢測及耐藥性分析大腸埃希菌是呼吸內科下呼吸道感染的常見菌，由于各種抗生素的廣泛使用，甚至濫用，使大腸埃希菌對各種抗生素的敏感性不斷下降，這些耐藥的產生與大腸埃希菌產生的超廣譜B吶酰胺酶(Extended-Spectrums-lactamase,ESBLs)AmpC酶有關［1,2］。文獻報道，大腸埃希菌對頭孢他啶、頭孢噻肟、哌拉西林等應用廣泛的抗生素敏感性逐年下降。為此，我們對本院呼吸內科住院塵肺患者分離的256株大腸埃希菌進行耐藥譜及ESBLs、AmpC酶檢測，指導臨床抗感染用藥。1材料與方法1.1實驗菌株：2006年7月-2010年7月呼吸內科住院下呼吸道感染患者臨床送檢的痰液標本。病人早晨漱口，深咳，取痰液送檢,連續3日。用SENSITITRE熒光法全自動快速微生物鑒定儀(Aris)進行菌株鑒定。大腸埃希菌ATCC25922為標準菌株。1.2藥敏試驗：將大腸埃希菌在LB液體培養基(OXOID)中于37C培養過夜，用LB培養液調整濁度至0.5麥氏濃度。采用Kirby-Bauer法。Mueller-Hinto瓊脂英國Oxoid公司），受試抗菌藥物共18種，分別是：哌拉西林（齊魯制藥公司）、哌拉西林/三哩巴坦美國Wyeth-Ayerst公司）、頭孢西丁（海南海藥公司海口制藥廠）、頭孢他啶（Galaxo-SmithklirB州公司）、頭孢噻肟（華北制藥凱瑞特公司）、頭孢曲松（中諾藥業公司）、頭孢毗肟（中美上海施貴寶制藥公司）、美羅培南（日本住友制藥株式會社）、阿米卡星上海旭東海普藥業公司）、環丙沙星廣州南新制藥有限公司）、左氧氟沙星江蘇豪森藥業股份有限公司）。取0.1ml菌液點于平板中央，用涂布棒均勻涂布整個平板，制成含菌平板。將抗生素藥敏紙片貼至含菌平板表面，35C孵育24小時，測量抑菌圈直徑。1.3大腸埃希菌ESBLs檢測：按照1?2方法進行菌液涂布瓊脂平板及貼藥敏紙片，35C孵育24小時，測量抑菌圈直徑。藥敏紙片為頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢他啶+克拉維酸和頭孢噻肟+克拉維酸。按照臨床實驗室標準化協會（CLSR）制定的標準鑒別敏感菌株和耐藥菌株，用WHONET軟件分析耐藥率［3］。按照CLSR的標準，當頭孢他啶或頭孢噻肟+克拉維酸的抑菌圈直徑減去頭孢他啶或頭孢噻肟的抑菌圈直徑大于等于5mm時為產耐藥酶ESBLs的菌株。1.4AmpC酶檢測:待檢菌酶粗提物的制備按NCCLS紙片擴散法的標準對所有菌株測定對頭孢西丁的敏感性。對其不敏感的菌株抑菌圈直徑V17mm)進行酶的粗提。將受試菌菌落制成0?5麥氏單位菌液，取50ul菌液加入12ml胰酶消化大豆肉湯于35C孵育4-6h于4C4000r/min離心20min,棄上清液，將沉淀經-20C與37C水浴反復凍融6次后過濾,濾液經MH瓊脂平板ATCC25922菌液接種于MH瓊脂平板上常規細菌培養陰性后于-20C保存待檢測。大腸埃希菌AmpC檢測三維試驗參照參考文獻［3］方法進行，在水解酪蛋白胨(MH)瓊脂平板上均勻涂布0.5麥氏單位的大腸埃希菌(ATCC25922)菌液，將FOX紙片貼于平板中央，用無菌刀片沿FOX紙片邊緣5mm處放射狀切一裂縫，裂縫里加入25ul酶粗提物，35C孵箱培養16-18h后，觀察抑菌圈的形狀，如果平皿上出現一個沿槽周圍生長指向FOX紙片的矢狀菌苔，即為三維試驗陽性。1.5數據統計：利用SPSS11.5軟件對實驗結果進行t檢驗及x??2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1ESBLs和AmpC酶檢出結果：從256株大腸埃希菌中檢出5株單產AmpC酶、58株單產ESBLs、3株同時產AmpC酶+ESBLs，檢出率分別為1.9%、22.7%.1.2%o2.2大腸埃希菌的耐藥譜：18種抗生素中美洛培南沒有檢測到耐藥菌，其他17種抗生素均有不同數量耐藥菌產生，大腸埃希菌對18種抗生素的耐藥譜見表1。2.3大腸埃希菌ESBLs、AmpC表型陽性菌的耐藥譜：供試的18種抗生素對大腸埃希菌ESBLs、AmpC表型陽性菌的耐藥率普遍高于陰性菌。哌拉西林全部耐藥，頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶對ESBLs、AmpC陽性菌的耐藥率很高，但是對ESBLs、AmpC陰性菌的耐藥率顯著降低，P<0.05。ESBLs、AmpC表型陽性的菌株耐藥譜比表型陰性的菌株更廣泛。ESBLs、AmpC表型陽性大腸埃希菌對18種抗生素的耐藥譜見表2。表1256株大腸埃希菌對抗生素的耐藥情況（％）表2ESBLs、AmpC表型陽性菌株對18種抗生素的耐藥率（%）單產AmpC酶、ESBLs及同時產AmpC酶+ESBLs菌株對18種監測抗生素美洛培南除外）的耐藥率均高于平均水平。3討論革蘭氏陰性桿菌對。吶酰胺抗生素耐藥的主要機制為產生各種。吶酰胺水解酶(2)0吶酰胺類抗生素作用靶位青霉素結合蛋白(PBPs)的改變，(3)細菌外膜通透性下降；(4)外排泵作用；(5)生物膜的形成［3,4］等。各種。吶酰胺水解酶的產生為其主要機制°AmpC酶和ESBLs是介導革蘭氏陰性桿菌對廣譜青霉素類和頭孢菌素類及單環0吶酰胺類抗生素產生耐藥性的兩大類0吶酰胺酶。AmpC酶于1988年首次被發現以來在世界各地均有報道，又稱誘導酶，它主要是由腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌等產生的一類0吶酰胺酶，可水解頭孢菌素類抗生素，導致產酶細菌如大腸埃希菌對這類抗生素特別是頭孢西丁產生耐藥，給耐藥性的控制帶來了困難。現已發現AmpC酶不僅由染色體介導，還可以由質粒介導，通常情況下其表達水平較低，且無臨床意義，但在0吶酰胺類抗生素等誘導劑的作用下則大量產生，導致其對多種0吶酰胺類抗生素的耐藥。許多文獻［4-7］證實這類酶作用于頭孢菌素而不被克拉維酸(又稱棒酸)所抑制。隨著0吶酰胺類抗生素，特別是頭孢菌類的普遍應用，臨床上耐藥菌株的產生已相當嚴重，給臨床治療帶來相當大的困難。本研究結果顯示：無論是單產AmpC酶、ESBLs菌株同時產AmpC酶+ESBLs對廣譜青霉素類和第二、三代頭孢菌素及單環0吶酰胺類抗生素均高度耐藥。單產ESBLs酶菌株對抗生素的敏感率低于不產酶菌株，與喹諾酮類、氨基糖苷類等多種抗菌藥物品存在交叉耐藥；美羅培南仍是所有被測藥物中對大腸埃希菌抗菌作用最強的抗生素，含酶抑制劑的抗生素具有很強的抑酶增效作用；頭霉類抗生素對大腸埃希菌的抗菌活性優于第1、2、3代頭孢菌素，部分菌株對頭霉素類耐藥，提示合并有其他耐藥機制；氟喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥率較高；部分產ESBLs菌株對頭孢他啶敏感，與我國流行菌株ESBLs基因型以CTX-M型為主有關［8］。單產AmpC酶菌株對第四代頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素較為敏感，對酶抑制劑復合制劑不敏感，與AmpC酶水解特征一致。質粒介導的AmpC酶和ESBLs常與其他耐藥基因相關聯，表現為多重耐藥，本結果也證實這一點。由于碳青霉烯類對0吶酰胺酶具有高度穩定性，與所有革蘭陰性菌的青霉素結合蛋白(PBPs)具有較高的親和力，特別是PBP2,同時極易進入細菌微孔蛋白D2通道，從而顯示強大的抗菌活性。治療AmpC酶和ESBLs引起的危重感染，應首選碳青霉烯類，第四代頭孢菌素頭孢毗肟對產AmpC酶的細菌感染有良好作用，但對產ESBLs菌則較差。隨著越來越多的新型抗菌藥應用于臨床，耐藥性是細菌針對抗菌藥應用造成選擇性壓力而進化的必然結果。產生AmpC酶和ESBLs大腸埃希菌對8-內酰胺類抗生素耐藥的主要原因，隨著產AmpC酶與ESBLs菌株的日益增多，其多重耐藥機制嚴重影響各類抗菌藥物的治療，給臨床抗感染治療帶來很大困難。因此，及時、準確地檢測AmpC酶與ESBLs菌株，為臨床提供細菌的耐藥分析，指導臨床合理應用抗生素，延緩耐藥的產生，控制耐藥株傳播等具有十分重要的意義。參考文獻GeorgeA,JacobyMD,ThaparA,etal.The0ew-lactamase<J].NenglJMed,2005,352(4):380-391.李國保，李沛，陸堅。呼吸重癥監護室常見細菌產AmpC酶和超廣譜8-內酰胺酶的檢測及耐藥性研究[J].中國感染控制雜志，2008(4):271-275.彭少華，金正江,羅蘭等.耐亞胺培南銅綠假單胞菌致醫院感染危險因素的病例對照研究[J]?中華流行病學雜志，2005,26(7):511-515.夏麗萍，康健，予潤江，等.Ampc酶誘導調節機制及治療對策的研究進展[J]?國外醫學呼吸系統分冊，2002,22(4):203.王林峰.質