主要步驟如下：取50mg左右的經(jīng)無水乙醇浸泡過的肌肉樣品，用滅菌的牙簽挑成細(xì)絲狀，自然晾十。轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加入500plDNA裂解液，加入5ml20mg/ml蛋白酶K振蕩混勻。55°C水浴保溫2?3小時，每隔10min搖勻一次。加入等體積的Tris飽和酚，搖勻，用封口膜封好，37C水浴2?3小時。每隔10min搖勻一次。10，000rpm離心10min，小心轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管中，加入等體積的酚/氯仿(1：1)，搖勻5?10min。10，000rpm離心10min，小心轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管中，加入等體積的氯仿，搖勻5?10min。10，000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管中，加入0.9倍體積的異丙醇以及0.1體積的3mol/LNaAc，搖勻1?2min。置于-20C冰箱中3小時。2.2魚類總DNA的純化試劑：70%乙醇，無水乙醇，1XTE(Ph8.0)、1%瓊脂糖。將2.2.1(6)的總DNA溶液，10，000rpm離心10min，去上清液，留下沉淀。用70%乙醇500pl洗脫，劇烈搖勻，用手指彈擊。重復(fù)此步驟一次。10，000rpm離心10min，去上清液，留下沉淀，加入500pl無水乙醇洗脫，劇烈搖勻，用手指彈擊。10，000rpm離心10min，去上清液，把離心管斜置于超凈工作臺中，自然晾十。加入50pl1XTE溶解DNA沉淀，用手指彈擊，室溫放置30min，取3plDNA用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測。每個DNA樣品分成兩份，一份一20C保存?zhèn)溆茫硪环?C保存進(jìn)行下一步實(shí)驗。1.3.1DNA的提取總DNA的提取采用改進(jìn)的高鹽法。1、 取魚背部肌肉約0.01g，揮發(fā)乙醇后放入1.5mlBuffer管中用無菌小剪刀剪碎，加入400pLSDS提取緩沖液和叩L20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55°C水浴鍋中水浴2h或者37C過夜，中間震蕩數(shù)次。2、 上清加入300應(yīng)的6M/LNaCl溶液，充分搖均，10,000g/min離心30min。3、 本文中加一步：上清移入新管加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)混合液，搖均，10,000g/min離心10min。4、 上清移入新管加入等體積異丙醇，-20C下沉淀1h以上，10,000g/min離心10min。5、 棄去上清液，沉淀用70%的酒精沖洗兩次，無水乙醇洗一次。6、 室溫下晾十，加入50由TE溶液溶解。-20C保存，備用。總DNA電泳檢測取3pLDNA樣品和1應(yīng)漠汾藍(lán)buffer混合，用1%的瓊脂糖凝膠在75V電壓下電泳30min，EB溶液染色15~20min，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。PCR擴(kuò)增體系與程序PCR反應(yīng)在UNOnBiometra儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增引物序列為AFbL：5，-ACCGAGACCAATGACTTGAARAACCACCGTTG-3,AFbR：5'-CTTTGGGAGTTAGGGGTGGGAG-3'。30pLPCR反應(yīng)體系包括：10xTaqBuffer3.0pLMgCl225mM-L-13.0pLdNTPS2.5mM-L-12.4pLAFbL20mM-L-10.6pmol/LAFbR20mM-L-10.6pmol/LDMSO1.5pLBSA0.1mg/ml1.0pLTaqpolymerase0.9UDNA模板1-2pL（約10ng）未足體積部分用無菌超純水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性3min,然后95笆變性45s,56笆退火1min,72°C延伸1min,共進(jìn)行32個循環(huán)，最后72。