細胞培養常用(chánɡyònɡ)技術第一頁，共一百一十七頁。Cell第一類研究方法形態觀察(guānchá)技術第二類研究方法生物化學分析(huàxuéfēnxī)技術第三類研究(yánjiū)方法V細胞生理學技術第四類研究方法其它實驗技術第二頁，共一百一十七頁。第一節細胞形態結構(jiégòu)觀察技術目鏡物鏡集光器載物臺光源1.普通(pǔtōng)光鏡的結構:（一）普通(pǔtōng)光學顯微鏡一、光學顯微鏡第三頁，共一百一十七頁。第四頁，共一百一十七頁。2.普通(pǔtōng)光鏡的成像原理2圖像樣品光線聚光器物鏡光學顯微鏡的光路圖第五頁，共一百一十七頁。分辨率分辨率指顯微鏡能將近鄰的兩個質點分辨清楚的能力，通常是用相鄰兩點間的距離來表示.與數值孔徑的關系：D=0.61λ/NA=0.61λ/N·sin(α/2)D為分辨率;λ為光波波長;要提高分辨率，可采取使用短波長光源、采用介質(jièzhì)折射率高的袖浸系、增大孔徑角以提高NA值等措施。第六頁，共一百一十七頁。倒置顯微鏡第七頁，共一百一十七頁。生長良好的細胞，在顯微鏡下可觀察到細胞透明度大，折光性強，輪廓不清。若細胞生長狀態不良，可見細胞輪廓增強，細胞折光性變弱，細胞胞質中出現空泡、脂滴和其他顆粒狀物質，細胞之間空隙增大，細胞形態不規則，甚至失去原有細胞的特點，產生(chǎnshēng)圓縮脫落，有時細胞表面及周圍出現絲絮狀物。顯微鏡觀察(guānchá)細胞(xìbāo)的生長狀態第八頁，共一百一十七頁。BMSCs第九頁，共一百一十七頁。培養細胞的生長(shēngzhǎng)過程第十頁，共一百一十七頁。Anip973第十一頁，共一百一十七頁。在普通光學顯微鏡下，細胞結構呈半透明狀，不易(bùyì)看清。往往將標本切片進行(jìnxíng)染色——提高可辨程度。移動臂蠟或樹脂包埋的樣品切片用鋼刀樣品切片蠟帶伸展在蓋玻片和載玻片之間的切片切片機第十二頁，共一百一十七頁。染色的原理未染色(rǎnsè)已染色(rǎnsè)第十三頁，共一百一十七頁。(二)暗視野顯微鏡這種顯微鏡使照明光線不能直接(zhíjiē)進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡。中央(zhōngyāng)遮光板第十四頁，共一百一十七頁。暗視野聚光器的設計原理視野的背景(bèijǐng)黑物體的邊緣亮第十五頁，共一百一十七頁。利用這種顯微鏡能見到小至5nm的質點，分辨率比普通(pǔtōng)顯微鏡高了40倍，有一些細胞器，如核、線粒體，均清晰可見。第十六頁，共一百一十七頁。(三)相差(xiānɡchà)顯微鏡由荷蘭物理學家F.Zernike(1932)發明：提高了活細胞結構的反差，從而解決了對活細胞觀察(guānchá)的難題。獲諾貝爾物理獎(1953)(phasecontrastmicroscope)光通過不同密度物質時滯留的時間不同，利用相差板，將厚度(hòudù)的差別轉化成明暗的差別，增加反差。第十七頁，共一百一十七頁。特點：在聚光器或光源上加了一環形(huánxínɡ)光闌(annulardiaphragm),在物鏡中加了一環形相板(annularphaseplate)。相差(xiānɡchà)顯微鏡的構造:上有一環形區，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物質）：環形區的設計深度（或高度）恰好(qiàhǎo)可使通過此區的光線提前或延后1/4λ光程差。環形光闌環形相板使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。第十八頁，共一百一十七頁。相差(xiānɡchà)顯微鏡的構造第十九頁，共一百一十七頁。相差(xiānɡchà)顯微鏡的光路圖解根據設計，只有未透過標本的直射光可通過相板環形區，而透過標本的偏折光則由相板其他部分通過。兩組光線和軸后發生(fāshēng)干涉現象。第二十頁，共一百一十七頁。兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差(fǎnchā)（正反差）——結構比周圍介質更加變暗。未透過(tòuɡuò)標本的直射光（通過相板環形區）與透過標本的偏折光（由相板其他部分通過）和軸后發生干涉：S-DSD如果(rúguǒ)為凹形相板：通過樣品的光線延后1/4λ-1/4λ-1/4λ第二十一頁，共一百一十七頁。則兩組光波相加，振幅加大，形成亮反差（負反差）——標本(biāoběn)結構比周圍介質更加變亮。S+DSD如果(rúguǒ)為凸性相板：由于標本的各種結構的厚度和折射系數(xìshù)不同，在相差顯微鏡下顯示出不同的明暗度。-1/4λ+1/4λ第二十二頁，共一百一十七頁。顯微鏡觀察(guānchá)

相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）活細胞對光線是透明的，光線通過活細胞時，波長和振幅幾乎沒有改變，所以用普通光鏡無法看清未經染色的活細胞。

20世紀30年代荷蘭Zernike

原理：利用光的衍射和干涉特性，把透過標本不同區域的光波的光程差轉變成振幅差，使細胞內各種結構(jiégòu)之間呈現清晰可見的明暗對比，從而使標本的各種結構(jiégòu)變得清晰。

第二十三頁，共一百一十七頁。相差顯微鏡觀察(guānchá)活細胞的步驟如下：調整(tiáozhěng)好相差顯微鏡

觀察(guānchá)瓶皿準備調光調焦與攝影細胞觀察第二十四頁，共一百一十七頁。第二十五頁，共一百一十七頁。(四)微分(wēifēn)干涉差顯微鏡Nomarski(1952)在相差(xiānɡchà)顯微鏡原理的基礎上發明的：又稱Nomarski相差顯微鏡，其優點是能顯示結構的三維立體投影影像。(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)與相差顯微鏡相比，其標本(biāoběn)可略厚一點，折射率差別更大。第二十六頁，共一百一十七頁。DIC顯微鏡首先DIC利用的是偏振光。此外，除了物鏡外，還增加(zēngjiā)了四個光學組件：偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer)。DIC顯微鏡使細胞的細微結構立體感特別強，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程(shēnɡwùɡōnɡchénɡ)的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。第二十七頁，共一百一十七頁。DIC顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡普通顯微鏡第二十八頁，共一百一十七頁。熒光(yíngguāng)顯微鏡的成象原理(五)熒光(yíngguāng)顯微鏡第二十九頁，共一百一十七頁。分裂細胞的免疫熒光圖像(túxiànɡ)不同(bùtónɡ)熒光染料標記(biāojì)抗體特異性結合免疫熒光技術抗原(細胞的蛋白質成分)第三十頁，共一百一十七頁。用熒光素標記抗體所顯示出的細胞中蛋白質的分布(fēnbù)狀態MPM-2DAPIMergedInterProMetaAnteTelo第三十一頁，共一百一十七頁。(六)激光(jīguāng)共聚焦顯微鏡(LaserConfocalMicroscope,LCM)光源(guāngyuán)：通過共聚焦可進行光學切片對固相、液相物體(wùtǐ)均可進行觀察特點：激光Q550MW型LCM第三十二頁，共一百一十七頁。二.主要電鏡制作(zhìzuò)技術三.掃描(sǎomiáo)隧道顯微鏡一.電鏡基本知識二、電子顯微鏡電鏡問世(wènshì)的必然性第三十三頁，共一百一十七頁。光學(guāngxué)顯微鏡→0.2μm電子顯微鏡→0.2nm透射(tòushè)電子顯微鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）第三十四頁，共一百一十七頁。電子顯微鏡與光鏡的主要(zhǔyào)區別電鏡光鏡電子束可見光電磁透鏡玻璃透鏡電磁聚焦機械聚焦超薄切片(0.05m)石蠟切片(1~10m)光源透鏡聚焦方式切片厚度圖像彩色圖像黑白圖像第三十五頁，共一百一十七頁。0.61λ

D=——————N·Sinα/2λ：波長(bōcháng)

N：介質(jièzhì)折射率

α：物鏡鏡口角（標本(biāoběn)在光軸的一點對物鏡鏡口的張角）通常α最大值可達140°，空氣中N=1，最短的可見光波長λ=450nm，因此，普通光鏡的最大分辨率是0.2μm。肉眼的分辨率為0.2mm，因此，光學顯微鏡的最大的放大倍數為1000。放大倍數=顯微鏡的分辨率人肉眼的分辨率分辨力(resolution)是指顯微鏡能將近鄰的兩個質點分辨清楚的能力，通常是用相鄰兩點間的距離來表示，可通過公式換算出：一、電鏡基本知識：第三十六頁，共一百一十七頁。各種(ɡèzhǒnɡ)光及電子束的波長第三十七頁，共一百一十七頁。Ruska(1933~1938)便選擇了電子束為光源來突破光學(guāngxué)顯微鏡分辨率的極限，發明了透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)。電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，其波長與發射(fāshè)電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。V1λμ第三十八頁，共一百一十七頁。透射(tòushè)式電子顯微鏡(TEM)第三十九頁，共一百一十七頁。中幼紅細胞透射電鏡血小板縱切面透射電鏡第四十頁，共一百一十七頁。由于(yóuyú)電子束不能透過玻璃，因此用于電鏡的標本須制成厚度僅有0.05m的超薄切片，并放在銅網上。這種切片需要用超薄切片機制作。電子顯微鏡的放大倍數最高可達近百萬倍。1.

超薄切片(qiēpiàn)技術二、主要電鏡制作(zhìzuò)技術：超薄切片銅網第四十一頁，共一百一十七頁。以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金屬鹽染色，以增大(zēnɡdà)黑白反差。第四十二頁，共一百一十七頁。用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸出處則沒有染料沉積，從而出現負染效果(xiàoguǒ)，分辨力可達1.5nm左右。示肌動蛋白纖維

2.負染色(rǎnsè)技術第四十三頁，共一百一十七頁。亦稱冰凍斷裂(freeze-fracture)，是研究生物膜內部結構的一種有用的技術，關于膜結構的許多資料(zīliào)即是利用這種方法取得的。冰凍(bīngdòng)斷裂技術也是研究細胞內部各種細胞器結構的有用手段。(freeze-etching)3.冰凍蝕刻技術(jìshù)第四十四頁，共一百一十七頁。①將標本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低溫冰凍。②然后用冷刀驟然(zhòurán)將標本沖斷開，升溫后冰在真空條件下迅即升華，暴露出了斷裂面結構——蝕刻(etching)。蝕刻斷裂冰凍蝕刻技術(jìshù)的操作步驟:第四十五頁，共一百一十七頁。③蝕刻后，再向斷裂上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后(ránhòu)將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下，此膜即為復膜(replica)。復膜④復膜顯示(xiǎnshì)出了標本蝕刻面的形態，可置于透射電鏡下觀察。電鏡下的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。第四十六頁，共一百一十七頁。細胞冰凍(bīngdòng)斷裂后的電鏡圖像第四十七頁，共一百一十七頁。電子槍發射出的電子束作為“探針”，在樣品表面進行掃描，電子束激發樣品表面放出次級電子，次級電子的多少(duōshǎo)與樣品表面的結構有關，被電荷的柵極收集后，即向電子顯象管發送信號，在熒光屏上相應位置顯示出明、暗差別。圖像為立體形象，反映了標本表面的真實結構。用來觀察標本的表面(biǎomiàn)形態結構。(scanningelectronmicroscope,SEM)4.

掃描電鏡技術(jìshù)第四十八頁，共一百一十七頁。當探針沿物質表面掃描時，使探針與物質表面間的距離不斷發生改變，從而引起電流不斷發生改變。將電流的這種改變圖象化，即可顯示(xiǎnshì)出原子水平的凹凸形形態。探針物質第四十九頁，共一百一十七頁。掃描式電子顯微鏡第五十頁，共一百一十七頁。掃描式電子顯微鏡第五十一頁，共一百一十七頁。耳聽毛的掃描電鏡圖像(túxiànɡ)第五十二頁，共一百一十七頁。第五十三頁，共一百一十七頁。第五十四頁，共一百一十七頁。其關鍵部件是有一個加上一定(yīdìng)電壓的精密探針，當探針接近物質時，由于‘隧道效應’而有電子飛出，從而在探針與物質之間有電流通過。1981年，Binnig、Rohrer等發明(fāmíng)：榮獲(rónɡhuò)1986年諾貝爾獎！據量子力學中隧道效應設計，用來顯示晶體表面原子布陣(scanningtunnelingmicroscope,STM)—+—+<100nm三、掃描隧道顯微鏡：第五十五頁，共一百一十七頁。分辨率：X-Y向0.1nm（原子級分辨率）第五十六頁，共一百一十七頁。掃描隧道顯微鏡能直接觀察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白質等)的原子布陣，也能觀察一些生物結構(如生物膜、細胞壁等)的原子排列,而不需要特別的制樣技術，并且探測過程對樣品無損傷——納米科學(kēxué)水平。掃描(sǎomiáo)隧道顯微鏡的優越之處：三態（固態、液態和氣態）物質均可進行觀察。第五十七頁，共一百一十七頁。細胞常用的觀察(guānchá)及染色方法第五十八頁，共一百一十七頁。活細胞的觀察(guānchá)檢測方法暗視野顯微鏡技術觀察活細胞縮時顯微鏡攝影(shèyǐng)觀察體外活細胞染色觀察第五十九頁，共一百一十七頁。暗視野顯微鏡技術觀察活細胞（darkfieldmicroscope)原理：利用特殊聚光器使光線不能進入物鏡，經過標本的散射光線使物鏡被放大，因此在黑暗背景中可呈現明亮的像。優點：反差增大，分辨率提高，可觀察到5nm的微小質點。應用：觀察活細胞內的細胞核、線粒體、細菌和霉菌等。縮時顯微攝影術觀察（time-lapsecinemicrophotagraphy，TLCM）優點：可直接(zhíjiē)記錄活細胞的連續動態變化過程，能非常直觀地展現細胞生長過程中的動態變化，如細胞運動、細胞分裂、細胞膜變化、細胞死亡等過程。缺點：較昂貴第六十頁，共一百一十七頁。體外活細胞(xìbāo)染色觀察體外活細胞染色(rǎnsè)就是在體外培養條件下，用某種染料對活細胞進行染色(rǎnsè)，而不影響活細胞生命活動的一種方法。利用這種方法，可以對培養物進行染色(rǎnsè)觀察，經染色(rǎnsè)的培養物還可以繼續進行培養。堿性染料(rǎnliào)酸性染料（臺盼藍、剛果紅、吡咯藍）活體染料噻嗪類（次甲基藍、甲苯胺藍）惡嗪類（亮焦油藍、亮焦油紫）丫嗪類（中性紅、詹納斯綠）三酚苯甲烷類（甲基紫、維克多利亞藍）第六十一頁，共一百一十七頁。中性(zhōngxìng)紅染色

常用活體染料，一般濃度為1：10000，用生理鹽水（或Hanks液）溶解后進行高壓蒸汽滅菌暗處存放，可直接浸染活體細胞顯微鏡下觀察或用于細胞的病毒蝕斑，肉眼計數空斑數目。因其毒性大，染色后細胞不能再培養。結晶紫染色使用濃度為0.1％，可用生理鹽水配制，室溫保存。該染料對死、活細胞均著色，故只能測出細胞總數。臺盼藍染色用0.5％濃度的臺盼藍（trypanblue)，用PBS配制，室溫保存，該染料只對死細胞著色，可測定活細胞數和計算存活百分率。第六十二頁，共一百一十七頁。E.coli以結晶(jiéjīng)紫(crystalviolet)染色第六十三頁，共一百一十七頁。B.cereus以石炭酸復紅(carbolfuchsin)染色(rǎnsè)第六十四頁，共一百一十七頁。aureus以甲烯藍(methyleneblue)染色(rǎnsè)第六十五頁，共一百一十七頁。二、培養(péiyǎng)細胞常用的染色方法細胞固定的基本方法細胞常用(chánɡyònɡ)的染色方法細胞特殊的染色方法第六十六頁，共一百一十七頁。1、細胞固定的基本(jīběn)方法固定組織、細胞的目的：把組織和細胞的原有結構盡可能完整地保存下來，避免組織和細胞發生降解、自溶、腐敗和變形等；同時，固定還可以使細胞的各部分易于著色，適于觀察、長期保存和分析。固定組織、細胞的原則：盡可能選用新鮮培養物；根據檢測工具、對象、目的和要求(yāoqiú)選擇固定劑和固定方法。第六十七頁，共一百一十七頁。固定前的準備：

各種細胞培養物，如雙蓋片懸滴培養物、懸液培養物、單層培養物和蓋片單層培養物都可作固定材料。

懸浮細胞：離心(líxīn)（800～1000r/min）→PBS/Hanks漂洗2～3次

貼壁細胞：用鑷子輕輕取出蓋片→PBS/Hanks漂洗2～3次注：漂洗的目的是去除血清和附著于細胞表面的殘渣，防止其妨礙染色。第六十八頁，共一百一十七頁。常用(chánɡyònɡ)固定液簡單固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸等混合固定液：甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4％多聚甲醛-PBS固定液等甲醇/醋酸固定液：甲醇：冰醋酸為3：1，現用現配，適用于Giemsa染色。FAA固定液：90mL80％酒精＋5mL冰乙酸＋5mL40％甲醛，適用于蓋片單層培養的細胞，固定效果(xiàoguǒ)好。Carnoy固定液：較好的非水溶性固定液，60mL純酒精＋30mL氯仿＋10mL冰乙酸，適用于顯示細胞化學成分。第六十九頁，共一百一十七頁。2、細胞(xìbāo)常用的染色方法H.E（蘇木精-伊紅）染色法原理：堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅分別與細胞核和細胞質發生反應(fǎnyìng)，使細胞的微細結構通過顏色而改變它的折射率，從而在光鏡下能清晰地呈現出細胞的圖像，并能提供良好的核漿對比染色。染色結果：細胞核染成紅色，細胞質染成藍色。第七十頁，共一百一十七頁。細胞(xìbāo)涂片或細胞(xìbāo)甩片的HE染色細胞涂片或細胞甩片的制備：對于貼壁細胞，可將蓋玻片放于培養器皿中，讓培養細胞長于玻片上，然后用藥物誘導細胞凋亡后取出，用4%多聚甲醛固定5min。對于懸浮細胞，用藥物誘導細胞凋亡后，離心(líxīn)1000r/min收集細胞，用PBS洗2次，收集調整細胞數為1X105/ml，涂片或用離心甩片，用4%多聚甲醛固定5min；蘇木素染色5min，用流水沖洗；鹽酸乙醇分化30秒；自來水浸泡15min；伊紅染色2min脫水，透明及封片按以下步驟：95%乙醇（I）1min，95%乙醇（II）1min，100%乙醇（I）1min，100%乙醇（II）1min，二甲苯石碳酸（3∶1）1min，二甲苯（I）1min，二甲苯（II）1min，中性樹膠封片；第七十一頁，共一百一十七頁。第七十二頁，共一百一十七頁。Giemsa（吉姆薩）染色法母液配制：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，將Giemsa粉置于研缽內先用少量甘油與之充分混合，研磨至無顆粒；然后將剩余甘油混在一起，56℃保溫2h后，加入33mL純甲醇，混勻，即為Giemsa母液，保存于棕色瓶內。染液配制：取9份pH6.8~7.38的Sorensen緩沖液和1份Giemsa母液混合即可。染色步驟：細胞標本用甲醇/醋酸固定液固定30min后，用滴管把染液布滿玻片上，染色10~15min，用自來水沖去多余染液，空氣干燥，二甲苯同名，光學樹脂封固。染色結果：細胞核染成紅色，細胞質染成藍色。注意事項：染液宜現配現用，保存時間最好不用超過(chāoguò)48h，Giemsa對pH極敏感，緩沖液pH要調準確。第七十三頁，共一百一十七頁。第七十四頁，共一百一十七頁。第七十五頁，共一百一十七頁。瑞氏染色(rǎnsè)觀察【材料與試劑】Wright染液：稱取Wright粉劑0.1g在碾缽內，充分碾磨，量取甲醇60ml，逐步加入，邊加邊碾磨，直到染料全部溶解，置試劑瓶中密封，1周后可用。Wright磷酸鹽緩沖稀釋液：Wright染液10ml，磷酸鹽緩沖液20ml。磷酸鹽緩沖液：磷酸二氫鉀6.63g，磷酸氫二鈉2.56g，蒸餾水1000ml。染色缸，離心涂片機，離心機，顯微鏡。其它：甲醇，0.08%醋酸(cùsuān)，中性樹膠。【操作方法】收集細胞（1×106），PBS洗1次；將以上細胞涂片或用離心甩片機制成細胞甩片；用甲醇固定3～5min；將標本玻片插入Wright染液缸中染色2min；再插入Wright磷酸緩沖稀釋液染色4～10min，用蒸餾水沖洗。如果顏色太深，可用0.08%醋酸分化數秒鐘；晾干，用中性樹膠封片；【結果判斷】

正常細胞核染成深藍色或藍紫色，色澤均一，第七十六頁，共一百一十七頁。3、細胞(xìbāo)特殊的染色方法Feulgen染色法Coomassie染色法PAS反應(fǎnyìng)法油紅O（oilredO）法免疫熒光染色法免疫酶染色法第七十七頁，共一百一十七頁。Feulgen（福爾根）染色法原理：在60℃條件下，DNA分子中的嘌呤堿和脫氧核糖的連鍵可被1mol/L鹽酸水解打開，游離出的脫氧核糖醛基能與希夫（Schiff）試劑結合，形成紫紅色復合物。在此過程中，RNA不受影響，故染色具DNA特異性。準確的溫度(wēndù)和鹽酸濃度，適宜的水溫、時間是成功的關鍵。水溫過度或不足均降低染色強度。

此法能對DNA進行特異性染色試劑配制：1mol/LHCL：濃HCL8.5ml＋蒸餾水91.5mlSchiff試劑：母液裝入棕色瓶，蓋緊，黑紙包裹置于暗處

染色過程：選用Carnoy固定液染色結果：細胞核染成粉紅色至紫紅色，胞質為無色。第七十八頁，共一百一十七頁。第七十九頁，共一百一十七頁。考馬斯亮藍（Coomassie，BB）染色法原理：顯示細胞骨架、細胞內微絲的染色方法試劑配制：固定液：0.1mol/LNaH2PO4·2H2O14.0mL＋0.1mol/LNa2HPO4·12H2O36.0mL＋蒸餾水50.9mL＋25％戊二醛50.0mL染色液：甲醇46.5mL＋冰醋酸7.0mL＋考馬斯亮藍0.02g染色過程(guòchéng)：染色結構：細胞內的微絲呈現藍色。第八十頁，共一百一十七頁。第八十一頁，共一百一十七頁。過碘酸席夫反應(fǎnyìng)法

（periodicacidSchiffreaction，PAS）

原理：過碘酸是一種強氧化劑，能將葡萄糖的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成兩個游離的醛基，它們與Schiff試劑反應生成紫紅色產物。

細胞內糖類的染色方法(fāngfǎ)試劑配制：染色過程：染色結果：細胞含糖原區呈紫紅色。第八十二頁，共一百一十七頁。第八十三頁，共一百一十七頁。細胞內脂類的染色(rǎnsè)方法蘇丹(sūdān)（Sudan）Ⅲ/Ⅳ法蘇丹黑法Lillie油紅O（oilredO）法Cain硫酸尼羅藍（Nile）法鋨酸（osmicacid）法第八十四頁，共一百一十七頁。第八十五頁，共一百一十七頁。第八十六頁，共一百一十七頁。油紅O（oilredO）法優點：油紅O染色的脂肪比蘇丹Ⅲ法染的顏色要深，對微小的脂滴易于顯示(xiǎnshì)，而且沉淀較少。

10％中性甲醛溶液的配制﹙pH7.0﹚：量取37％~40％甲醛20mL，蒸餾水180mL，加入0.8g磷酸二氫鈉﹙NaH2PO4·H2O﹚、1.3g磷酸氫二鈉﹙Na2HPO4﹚，配制成200mL10％中性甲醛溶液，密封備用。第八十七頁，共一百一十七頁。第八十八頁，共一百一十七頁。一．免疫熒光細胞(xìbāo)化學技術

免疫熒光技術是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微顯示的精確性相結合。用已知的抗體在不影響其免疫學特性的前提下與熒光素相結合。然后將結合了熒光素標記的抗體作為一種標準試劑。對被檢細胞進行檢測和鑒定(jiàndìng)。并在熒光顯微鏡下采用一定波長的熒光，可以直接觀察被檢測中有否特異熒光的表達。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃（FITC）、四乙基羅丹明（RB200）、四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）及藻紅蛋白（PE）在流式細胞術（FCM）中較常用。較為經典的方法有下列幾種：第八十九頁，共一百一十七頁。（一）直接法是以熒光標記抗體直接與被檢標本內的抗原反應。依據熒光出現(chūxiàn)的位置及強弱對被檢細胞做出判別。該法的優點為簡單特異。但其缺點也很明顯即敏感性較低另需制備大量特異性的熒光抗體。（二）間接法間接法采用抗球蛋白試驗原理，先制成熒光素標記抗抗體。檢測中先將特異性抗體與被檢標本作用一定的時間后，充分洗去未結合的游離特異性抗體，然后添加熒光素標記抗抗體使之形成被檢抗原－抗體－熒光素標記抗抗體復合物，由此顯示特異熒光并因復合物上帶有較多熒光標志物，所以其敏感性比直接法要高。第九十頁，共一百一十七頁。組織(zǔzhī)切片組織(zǔzhī)切片直接(zhíjiē)法間接法Ab1-熒光Ab1Ab2-熒光免疫熒光法原理圖第九十一頁，共一百一十七頁。（三）補體法這是一種(yīzhǒnɡ)間接法的改良。既在抗原抗體反應時加入補體，然后再與熒光素標記的抗補體抗體結合形成抗原－抗體－抗補體熒光抗體復合物。此法敏感性較高。但其較易出現非特異性染色，而且操作過程相對較復雜。（四）雙標記法運用兩種熒光素在不同的激發光下顯示不同顏色的特點，將不同熒光素分別標記所需的特異性抗體。可在同一標本上測定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用間接法進行。若分別采用兔源性和鼠源性等不同種屬的抗體，甚至可進行三重或多重標記法。第九十二頁，共一百一十七頁。加入3%多聚甲醛固定(gùdìng)細胞，固定(gùdìng)30min后棄去。PBS洗滌3次，每次5min。加5%Tritoon-X100室溫溫和震蕩15min，PBS洗滌3次，每次5min。室溫下，加1%山羊血清封閉1h，同時在水平搖床溫和振蕩孵育。以1：200比例加入一抗，室溫下振蕩孵育1h，PBST洗滌3次，每次5min。以1：200比例加入FITC標記的羊抗鼠二抗，室溫下振蕩孵育1h，PBST洗滌3次，每次5min。最后加入DAPI(1：1000)進行核染色5min，PBS洗滌1次，立即到熒光顯微鏡下觀察。第九十三頁，共一百一十七頁。第九十四頁，共一百一十七頁。單色熒光(yíngguāng)染色第九十五頁，共一百一十七頁。雙色熒光(yíngguāng)染色第九十六頁，共一百一十七頁。多色熒光(yíngguāng)染色第九十七頁，共一百一十七頁。第九十八頁，共一百一十七頁。二、免疫酶細胞(xìbāo)化學技術

免疫酶細胞化學技術是將抗原－抗體反應的特異性與酶的高效，快速催化作用彼此結合，由此形成一種既具有免疫熒光、放射免疫的優點，又避免了他們的缺點。這項技術的原理和操作與熒光法有許多相似之處，所不同的是用酶來替代熒光素作為標志物，并采用底物被酶分解后的顯色反應來顯示抗原抗體的結合與否。選用的標記酶有辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD）、β－D半乳糖苷酶（β－D－Gal）等。以上這些酶因其純度和活性及產品性質相對較穩定且部分已制成試劑盒出售(chūshòu)。目前已廣泛地被臨床和實驗室所應用第九十九頁，共一百一十七頁。

細胞二步酶標法三步酶標法Ab1-酶基團(jītuán)Ab1Ab2-酶基團(jītuán)免疫酶標法原理圖第一百頁，共一百一十七頁。（一）

辣根過氧化酶免疫(miǎnyì)酶標記法

辣根過氧化酶是從辣根中提取的一種糖蛋白，其作用底物為供氫體和過氧化物。目前常用的供氫體為二氨基聯苯胺（DAB）。在酶反應過程(guòchéng)中DAB不斷供給復發物電子，使其成為在光鏡下能觀察到的不溶性深棕色多聚合物。定位與酶活力處即抗原－抗體反應部分。現常用的方法有---直接法;間接法;抗體－橋聯法;過氧化酶－抗－過氧化酶復合物法（PAP）;親和素－生物素－過氧化酶復合物法（ABC）等。在組織細胞相關抗原檢測中通常使用PAP法和ABC法這兩種。第一百零一頁，共一百一十七頁。第一百零二頁，共一百一十七頁。（二）免疫堿性磷酸酶標記法堿性磷酸酶是一種磷酸酯的水解酶。從大腸桿菌中提取的此酶最適PH為8.0左右。其作用的底物有磷酸萘酚AS－MX和磷酸萘酚AS－BI，顯色的偶聯劑可采用固紅-GBC和固藍-BB等。免疫堿性磷酸酶染色方法(fāngfǎ)很多，有直接法；間接法；APAAP法；ABC－AP法；但APAAP法和ABC－AP法二種，較為常用，且這二種方法(fāngfǎ)其敏感性和特異性均較滿意。第一百零三頁，共一百一十七頁。在被檢細胞(xìbāo)周圍(或細胞(xìbāo)內)見到紅色沉淀物，即為陽性反應CD13+第一百零四頁，共一百一十七頁。免疫酶橋聯(APAAP)法染色(rǎnsè)原理細胞(xìbāo)Ab-1（Mo）Ab-2（Ho）Ab-3（Mo）第一百零五頁，共一百一十七頁。APAAP步驟(bùzhòu)1、固定細胞（冰凍切片或細胞涂片不需抗原修復）。2、阻斷內源性過氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30%H2O2)室溫(shìwēn)20分鐘。水洗。3、滴加正常血清37℃，30分鐘。4、適當稀釋的特異性抗體，37℃60分鐘，或4℃過夜。5、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。6、甩橋抗體，37℃40分鐘或室溫1小時。7、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。8、滴加適當稀釋的APAAP復合物，37℃30分鐘。9、TBS或PBS（pH7.2）洗3次。10、滴加AKP底物溶液，37℃15——30分鐘，陽性結果顯現清晰后流水沖洗。11、復染（核固紅或蘇木素或甲基綠）1—2分鐘，常規沖洗后，封片。第一百零六頁，共一百一十七頁。APAAP法APAAP：屬于非標記抗體法，通過具有高特異性的抗堿性磷酸酶抗體，并在抗酶抗體中加入大量的堿性磷酸酶，使堿性磷酸酶充分結合在抗酶抗體上，形成可溶性的APAAP復合物，常用的顯色劑為BCIP/NBT、固紅或固藍。特點不會與內源性過氧化物酶反應，所以背景(bèijǐng)較為干凈，特別適合內源性過氧化物酶較多的組織，如肝、腎。第一百零七頁，共一百一十七頁。Ab-1細胞(xìbāo)生物素化二抗ABC復合物生物素化Biotion（HRP/AP）ABC法染色(rǎnsè) 原理圖卵白(luǎnbái)素（Avidin）第一百零八頁，共一百一十七頁。ABC法（SP、SABC法步驟(bùzhòu)相同）ABC(avidin-biotincomeplex)卵白素-生物素復合物法屬于親和免疫組織化學技術(jìshù)，根據卵白素-生物素高親和力的生物學特性。而S-P、SABC是以標記了過氧化物酶的抗生物素蛋白鏈酶素（SA）代替ABC復合物，但由于SA分子量較小，穿透性較好，反應速度較快,敏感性高，復合物也不需要使用前混合，更為簡單方便。ABC為三步法，第二抗體為生物素化的IgG（或IgM、IgA等），其中的Fab片段與第一抗體結合，這就要求與第一抗體相配對，如第一抗體是鼠抗，第二抗體應該為抗鼠的（或IgM、IgA等）。由于卵白素和生物素親和力強，故ABC較PAP敏感20-40倍。最后通過復合物上的過氧化物酶與顯色反應形成有顏色的沉淀物，可用顯微鏡觀察。第一百零九頁，共一百一十七頁。ABC法步驟(bùzhòu)：1、固定細胞（冰凍切片或細胞涂片不需抗原(kàngyuán)修復）。2、阻斷內源性過氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30%H2O2)室溫20分鐘。水洗。3、抗原修復：蒸餾水洗，放入抗原修復液（Ph6.0）內微波修復20分鐘，快速冷卻.4、pH7.2TBS緩沖液洗三次。5、滴加正常血清37℃，30分鐘。6、加一抗37℃，30分鐘.pH7.2TBS緩沖液洗三次。7、滴加二抗，37℃，30分鐘,pH7.2TBS緩沖液洗三次。8、滴加ABC復合物，37℃，反應45分鐘。pH7.2TBS緩沖液洗三次。9、DAB顯