診斷牛環形泰勒蟲病的PCR方法建立,基因工程論文環形泰勒蟲病又稱熱帶泰勒病，是由泰勒蟲屬的環形泰勒蟲感染牛引起的一類蜱傳性血液原蟲病〔蔣金書，２０００〕。本病流行區域廣泛，在北美、東歐、北非和亞洲地區均有分布〔Ｄｏｌａｎ，１９８９；Ｓｅｒｖｉｃｅ等，２００１〕，是牛最嚴重的寄生蟲病之一。環形泰勒蟲病在中國廣泛分布，新疆、甘肅、寧夏、內蒙古等１９個省區均有報道〔呂文祥等，１９９５；Ｌｕｏ等，１９９７〕。臨床異常感覺和狀態主要為食欲不振、發熱、淺表淋逢迎腫大、心跳過快、呼吸困難、貧血等〔汪明，２００８〕；急性病例可見白細胞、淋巴細胞減少等典型血液學變化；慢性病例可致乳牛產奶量下降。近年來，環形泰勒蟲的發病呈上升趨勢，為養牛業的發展帶來重大危害。有效的診斷對于減少該病引起的損失至關重要，而傳統的血涂片鏡檢法固然操作簡單、用時較短，但當血液中的蟲體數量下降到一定程度時，該法診斷容易漏檢，故其準確性遠達不到診斷和檢測的要求〔志勝等，２００４〕。因此選擇一種適宜的診斷方式方法顯得尤為重要。分子生物學診斷方式方法是近年來迅速發展起來的一種診斷方式方法，在寄生蟲病診斷和研究中應用越來越廣泛，且分子生物學診斷方式方法有替代傳統診斷方式方法的趨勢，因而利用分子生物學工具對環形泰勒蟲進行檢測和流行病學調查意義重大。聚合酶鏈式反響〔ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ〕作為一種普遍的分子生物學工具在各類寄生蟲病的診斷中應用廣泛。Ｂｉｓｈｏｐ等〔１９９２〕初次將ＰＣＲ技術應用于泰勒蟲病的診斷。Ｏｌｉｖｅｉｒａ等〔１９９５〕使用裂殖子主要外表抗原〔Ｔａｍｓｌ〕特異性引物，對采集的９２份牛血樣進行了環形泰勒蟲的ＰＣＲ檢測，檢出率為７５％，與血涂片鏡檢法２２％的檢出率和免疫熒光抗體檢測４０％的檢出率相比，ＰＣＲ檢測方式方法具有靈敏度高的優越性。故ＰＣＲ方式方法因其良好的特異性和較高的敏感性而廣泛應用，不失為環形泰勒蟲病診斷的一種好方式方法。在應用ＰＣＲ技術檢測寄生蟲感染時，良好的靶標序列的選擇是非常重要的。環形泰勒蟲裂殖體外表蛋白〔Ｔｈｅｉｒｅｌｉａａｎｎｕｌａｔａｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ，ＴａＳＰ〕是環形泰勒蟲蟲體發育階段分泌出的一種膜內蛋白，其不但具有良好的免疫原性，作為一種關鍵的分子標記基因，在分子診斷方面同樣具有重要的應用價值〔Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ等，２００２〕。Ｓａｄｒ－Ｓｈｉｒａｚｉ等〔２０１２〕研究發現，ＴａＳＰ基因固然顯示出種內和種間的多態性，但不同來源的ＴａＳＰ蛋白有一個共同的保守區，這一特性表示清楚，ＴａＳＰ基因是潛在的分子生物學診斷靶標序列。Ａｌ－Ｓａｅｅｄ等〔２０１０〕研究結果表示清楚，基于ＴａＳＰ基因建立的ＰＣＲ檢測方式方法可用于環形泰勒蟲病的流行病學調查。因而本試驗以ＴａＳＰ基由于靶標序列，根據ＧｅｎＢａｎｋ登錄的牛環形泰勒蟲ＴａＳＰ基因序列保守區設計合成１對引物，建立診斷牛環形泰勒蟲病的ＰＣＲ方式方法。１材料與方式方法１．１蟲種與菌株試驗用環形泰勒蟲〔Ｔ．ａｎｎｕｌａ－ｔａ〕、中華泰勒蟲〔Ｔ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ〕、瑟氏泰勒蟲〔Ｔ．ｓｅｒ－ｇｅｎｔｉ〕、尤氏泰勒蟲〔Ｔ．ｕｉｌｅｎｂｅｒｇｉ〕、呂氏泰勒〔Ｔ．ｌｕｗｅｎｓｈｕｎｉ〕、綿羊泰勒蟲〔Ｔ．ｏｖｉｓ〕、馬泰勒蟲〔Ｔ．ｅｑｕｉ〕、駑巴貝斯蟲〔Ｂ．ｃａｂａｌｌｉ〕、牛巴貝斯蟲〔Ｂ．ｂｏｖｉｓ〕均由中國農業科學院蘭州獸醫研究所／蟲種資源保藏課題組提供；大腸桿菌ＪＭ１０９購自ＴａＫａＲａ公司。１．２主要試劑ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ凝膠回收試劑盒、ＤＮＡ提取試劑盒、質粒提取試劑盒、ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ載體均購自ＴａＫａＲａ公司；ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ購自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常規試劑為進口或國產分析純。１．３方式方法１．３．１目的基因ＰＣＲ擴增、克隆及測序根據ＧｅｎＢａｎｋ上頒布的牛環形泰勒蟲ＴａＳＰ基因序列〔登錄號：ＡＹ２７４３２９．１〕，應用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０軟件設計合成１對特異性引物，引物序列為：ＴａＳＰ－Ｆ：５－ＧＡＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣＣＴＡＴＣ－３；ＴａＳＰ－Ｒ：５－ＴＴＣＣＣＧＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣＡＴＣ－３。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。取感染蟲血３００Ｌ，參考基因組ＤＮＡ提取試劑盒進行牛環形泰勒蟲基因組的提取。提取的基因組ＤＮＡ置－２０℃保存備用。ＰＣＲ反響體系５０Ｌ：１０Ｂｕｆｆ－ｅｒ５Ｌ，ｄＮＴＰｓ〔２．５ｍｍｏｌ／Ｌ〕４Ｌ，ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶〔５Ｕ／Ｌ〕０．２５Ｌ，基因組ＤＮＡ模板１Ｌ，上、下游引物〔２５ｐｍｏｌ／Ｌ〕各１Ｌ，加滅菌水至終體積為５０Ｌ。ＰＣＲ反應條件為：９４℃預變性４ｍｉｎ；９４℃變性１ｍｉｎ，５５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５個循環；７２℃延伸８ｍｉｎ。反響結束后?。担蹋校茫耶a物用１．５％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。對ＰＣＲ產物利用ＤＮＡ凝膠回收試劑盒進行膠回收，將回收產物與ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ載體連接，氨芐青霉素〔Ａｍｐ〕挑選陽性克隆，將ＰＣＲ鑒定為陽性的克隆質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。１．３．２特異性試驗以環形泰勒蟲基因組ＤＮA為試驗樣本，以環形泰勒蟲、中華泰勒蟲、瑟式泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、馬泰勒蟲、駑巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲基因組為對照檢驗本試驗方式方法的特異性。１．３．３敏感性試驗對提取的環形泰勒蟲基因組ＤＮＡ模板連續１０倍稀釋，使濃度梯度為１００至１０－１１，根據上述反響條件進行ＰＣＲ擴增。１．３．４臨床樣品檢測采集甘肅環形泰勒蟲病流行區血樣１５０份，采集前動物無明顯臨床異常感覺和狀態。采血前耳尖末梢血涂片染色鏡檢，對采集的血液樣本處理后用上述ＰＣＲ方式方法檢測。２結果與分析２．１牛環形泰勒蟲ＴａＳＰ基因的擴增及測序結果以提取的牛環形泰勒蟲基因組ＤＮＡ為模板進行ＰＣＲ擴增，其產物經１．５％瓊脂糖凝膠電泳，結果擴增出３９３ｂｐ的目的基因片段〔圖１〕，與預期結果一致。將該目的片段膠回收后克隆至ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ載體，轉化后，ＰＣＲ鑒定為陽性的克隆質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。經ＤＮＡＳ－ｔａｒ軟件分析，基因序列與設計引物時所選片段〔ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＡＹ２７４３２９〕的類似性為９３．２％〔圖２〕。２．２ＰＣＲ特異性試驗用本試驗建立的方式方法對環形泰勒蟲、中華泰勒蟲、瑟式泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、馬泰勒蟲、駑巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲分別進行檢測，結果見圖３。由圖３可知，只要環形泰勒蟲能擴增出預期的條帶，表示清楚該方式方法特異性好。２．３ＰＣＲ靈敏度試驗對環形泰勒蟲基因組ＤＮＡ模板進行不同濃度梯度的稀釋，當稀釋到１０－１０時，仍然能檢測到目的條帶〔圖４〕２．４臨床樣本的檢測對甘肅省肅北縣牛環形泰勒蟲病流行地區采集的１５０份血液樣本進行ＰＣＲ擴增和血液涂片鏡檢，陽性率為２６％〔３９／１５０〕，而血涂片染色鏡檢的陽性率僅為５．３％〔８／１５０〕。３討論環形泰勒蟲病是嚴重危害牛的一種寄生蟲病，近年來隨著養牛業的發展和牛的頻繁交易，環形泰勒蟲的流行區域在逐步擴大，發病率也隨之升高，給養牛業帶來了宏大損失。當前中國對環形泰勒蟲病的診斷主要還是依靠血涂片染色檢查。固然血涂片染色鏡檢方式方法方便快速、應用較廣，但當環形泰勒蟲隱性感染和紅細胞染蟲率較低時，檢測較為困難。同時由于血涂片制作及染色技術等原因，常規血涂片染色方式方法敏感率較低，常出現誤診。因此利用基因工程技術建立分子生物學診斷方式方法不失為一種好的選擇。ＰＣＲ是在體外模擬ＤＮＡ自我復制的核酸擴增技術，與其他診斷方式方法相比，ＰＣＲ方式方法特異性強、敏感度高，當前已廣泛應用于疾病的診斷。據報道，ＰＣＲ的靈敏度為１Ｌ血樣中１個梨形蟲，因此建立環形泰勒蟲ＰＣＲ診斷方式方法有很大的應用價值〔Ｋｉｒｖａｒ等，１９９８〕。據報道，環形泰勒蟲ＰＣＲ診斷方式方法較好的靶標序列是核糖體ＲＮＡ〔１８ＳｒＲＮＡ〕〔羅金等，２０１１；Ａｄａｍ，２００１〕基因序列。大量研究結果表示清楚，一些保守的抗原基因在候選診斷抗原方面具有重要的潛在應用價值〔羅金等，２０１２；王軼男等，２０１２〕。因而，以潛在抗原蛋白為目的序列建立的一系列診斷方式方法得到了廣泛的應用。ＴａＳＰ基因是利用抗裂殖體免疫血清挑選環形泰勒蟲ｃＤＮＡ表示出文庫得到的一種單拷貝基因〔Ｓｅｉｔｚｅｒ等，２００７〕，在孢子體和裂殖體階段表示出，具有較好的免疫原性，同時該蛋白基因是高度保守的，因此可作為診斷和預防環形泰勒蟲病的理想抗原。本研究以環形泰勒蟲ＴａＳＰ基因序列保守區設計１對特異性引物，建立了環形泰勒蟲病原體ＰＣＲ診斷方式方法。本試驗將ＰＣＲ產物克隆測序后，顯示該基因序列為環形泰勒蟲高免疫原區片段。利用該片段作為檢測序列，以中華泰勒蟲、瑟式泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、馬泰勒蟲、駑巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲的基因組作為對照，均沒有特異性條帶出現。同時將環形泰勒蟲基因組模板倍比稀釋，當稀釋度到達１０－１０時，仍然能檢測到目的條帶的出現，講明本試驗建立的ＰＣＲ檢測方式方法具有特異性高、敏感性好的特點。利用本試驗建立的方式方法和血涂片法對甘肅省肅北縣牛環形泰勒蟲病進行檢測，對收集的１５０份牛血樣檢測顯示，ＰＣＲ診斷方式方法的陽性率為２６％〔３９／１５０〕，高于血涂片染色鏡檢的陽性率５．３％〔８／１５０〕，兩者符合率為１００％。表明本試驗建立的ＰＣＲ診斷方式方法具有一定的可靠性和準確性。本試驗建立的ＰＣＲ診斷方式方法為環形泰勒蟲病的快速診斷提供了條件，也對環形泰勒蟲的鑒別診斷及分子流行病學調查具有重大應用意義。參考文獻１王軼男，賈立軍，薛書江，等．牛瑟氏泰勒蟲ＩＴＳ基因ＰＣＲ診斷方式方法的建立［Ｊ］．中國畜牧獸醫，２０１２，３９〔８〕：８０～８３．２呂文祥，呂文順，張其才，等．我們國家牛蜱傳性血液原蟲的蟲種調查和分布特征的研究［Ｊ］．中國獸醫科技，１９９５〔８〕：１３～１６．３汪明．獸醫寄生蟲學［Ｍ］．第３版．北京：中國農業大學出版社，２００８．４羅金，劉光遠，田占成，等．基于１８ＳｒＲＮＡ基因序列的我們國家馬梨形蟲分類學地位分析［Ｊ］．動物分類學報，２０１１，３６〔１〕：９９～１０３．５羅金，劉光遠，田占成，等，基于環形泰勒蟲Ｔａｍｓ１基因多態性的二溫式－ＰＣＲ檢測方式方法的建立［Ｊ］．中國農業科學，２０１２，４５〔２０〕：４３００～４３０９．６志勝，羅建勛，殷宏，等．環形泰勒蟲病診斷技術的發展大概情況［Ｊ］．青海畜牧獸醫雜志，２００４，１：３７～３９．７蔣金書．動物原蟲病學［Ｍ］．北京：中國農業大學出版社，２０００．８ＡｄａｍＲＤ．ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＧｉａｒｄｉａｌａｍｂｌｉａ［Ｊ］．ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅ－ｖｉｅｗ，２００１，１４〔３〕：４４７～４７５．９Ａｌ－ＳａｅｅｄＡＴＭ，ＯｍｅｒＬＴ，ＡｂｄｏＪ，ｅｔａｌ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｒｏｐｉｃａｌｔｈｅｉｌｅｒｉｏｓｉｓ〔Ｔｈｅｉｌｅｒｉａａｎｎｕｌａｔａｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｃａｔｔｌｅ〕ｉｎＫｕｒｄｉｓｔａｎＲｅｇｉｏｎ，Ｉｒａｑ［Ｊ］．ＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，１０６〔２〕：４０３～４０７．１０ＢｉｓｈｏｐＲ，ＳｏｈａｎｐａｌＢ，ＫａｒｉｕｋｉＤＰ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｃａｒｒｉｅｒｓｔａｔｅｉｎＴｈｅｉｌｅｒｉｐａｒｖａ－ｉｎｆｅｃｔｅｄｃａｔｔｌｅｂｙｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９２，１０４〔Ｐｔ２〕：２１５～２３２．１１ＤｏｌａｎＴＴ．Ｔｈｅｉｌｅｒｉｏｓｉｓ：Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＲｅｖＳｃｉＴｅｃｈｏｆｆＩｎｔＥｐｉｚｏｏｔ，１９８９，８：１１～３６．１２ｄＯｌｉｖｅｉｒａＣ，ｖａｎｄｅｒＷｅｉｄｅＭ，ＨａｂｅｌａＭＡ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴｈｅｉｌｅｒｉａａｎｎｕｌａｔａｉｎｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｏｆｃａｒｒｉｅｒｃａｔｔｌｅｂｙＰＣＲ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，３３〔１０〕：２６６５～２６６９．１３ＫｉｒｖａｒＥ，ＩｌｈａｎＴ，ＫａｔｚｅｒＦ，ｅｔａｌ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴｈｅｉｌｅｒｉａｌｅｓｔｏ－ｑｕａｒｄｉ〔ｈｉｒｃｉ〕ｉｎｔｉｃｋｓ，ｓｈｅｅｐ，ａｎｄｇｏａｔｓｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａ［Ｊ］．ＡｎｎａｌｓｏｆｔｈｅＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ－ｅｎｃｅｓ，１９９８，８４９〔１〕：５２～６２．１４ＬｕｏＪ，ＬｕＷ．ＣａｔｔｌｅｔｈｅｉｌｅｒｉｏｓｉｓｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．ＴｒｏｐｉｃａｌＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈａｎｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９９７，２９〔４〕：４Ｓ～７Ｓ．１５ＳｅｒｖｉｃｅＭＷ，ＡｓｈｆｏｒｄＲＷ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆａｒｔｈｒｏｐｏｄ－ｔｒａｎｓ－ｍｉｔｔｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｏｆｍａｎａｎｄｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄａｎｉｍａｌｓ［Ｍ］．ＵＫ：ＣＡＢＩＰｕｂｌｉｓ