引物設計原則及PP設計軟件第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日PCR引物設計及相關軟件使用→←SenseprimerAntisenseprimer選擇模板序列保守區域第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日1、引物設計原則引物長度堿基分布的均衡性Tm值引物二級結構引物3’端引物5’端引物的內部穩定性自由能分布第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物長度

一般引物的長度為15-30bp，常用的長度為18-21bp。過長或過短都不合適，為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應，長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。引物過短會引起錯配現象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（18bp的序列在人類基因組中只會出現一次）。決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度Tm=（g+C）*4+（a+T）*2第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日同一堿基連續出現不應超過5個GC含量一般40-60%，以45-55％為宜GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發非特異擴增。堿基分布的均衡性有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物Tm值一般要求：55℃-65℃。應盡可能保證上下游引物Tm值一致，一般差異控制在2℃以內。（引物的退火溫度相差小于5℃一般不會影響PCR的產率，理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～80℃間變化，有說接近72℃為最佳）上下游引物Tm值與產物Tm值一般應控制在20℃以內。一般采用較低引物Tm值-5℃作為PCR退火溫度。一對引物的GC含量和Tm值應該協調。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5'端加上一些A或T。第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物二級結構引物二聚體（引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性

）盡可能避免兩個引物分子之間3’端有較多堿基互補發夾結構（引物自身連續互補堿基不能大于3bp）尤其是要避免引物3’端形成發夾結構，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。（兩項結構的能值以不超過4.5為好，引物中間或5’端可適當放寬）兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性。第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物3’端引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗。引物3’端的堿基一般不用A（3’端堿基序列最好是G、C、CG、GC）。另外引物間3’端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。3’端的連續3個G或C，如GGG或CCC，會導致引物在G+C富集序列區錯誤引發第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基（對PCR影響不大），常在5’端引入修飾位點或標記物。5’端加上限制性核酸內切酶位點序列（酶切位點5’端加上適當數量的保護堿基）。5’端的某一位點修改某個堿基，人為地在產物中引入該位點的點突變以作研究。5’端標記放射性元素或非放射性物質（如生物素、地高辛等）。雙酶切位點，有利于定向克隆，2-3個保護堿基，一般加CG。計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物的內部穩定性過去認為，引物3’端應牢牢結合在模板上才能有效地進行延伸，故3’端最好為G或C。現在的觀點認為，引物的5’端應是相對穩定結構，而3’端在堿基配對的情況下最好為低穩定性結構，即3’端盡可能選用A或T（有說不適宜用A），少用G或C。若模板不很清楚，引物3’端最后一個堿基最好為T，其次是G或C，而不選A，國外資料表明，當末位為T時，即使在錯配的情況下也能引發鏈的合成，而末位為A時，錯配時引發大大降低，G或C居中，可見，模板很清楚時選A可以提高特異性。第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日自由能分布?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性（結合的強弱程度）。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超過9（絕對值，一般考慮末端5個堿基的ΔG。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3’末端穩定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發。因此在復雜模板的擴增體系中，3’末端5聚體的ΔG應大于-9.0kcal/mol），如此則有利于正確引發反應而可防止錯誤引發。引物的3’端的?G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。（能值越高越容易結合）3′末端雙鏈的ΔG是0～－2kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產量逐漸下降，在－6時只有40%、到－8時少于20%、而－10時接近于0。第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日引發效率（引物唯一性）選用的引物序列就應當是唯一的，即在模板中沒有重復序列好的設計工具會提供一個引物異位引發的評價指標，如Oligo6.0的falseprimingefficiency，即異位引發效率，這個值是由程序根據引物自身二級結構的能量、錯配的類型、錯配離3'末端的距離等因素綜合計算而得出，當此值大于200時便很有可能引發擴增。如所用工具無量化指標，則可依據經驗，當引物與模板在非預期位置退火，超過70%的堿基能互補配對，或引物3’末端連續8個或以上堿基配對，則認為有引發的可能。第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日2、引物設計軟件Oligo6（引物評價）*PrimerPremier（自動搜索）*VectorNTISuit（綜合分析）PrimerExpress(實時定量PCR引物和探針設計)OmigaDnastarPrimer3（在線服務）*第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日3、同源序列比較NCBI的BLAST;ExPASy的AlignmentGeneDoc3.2ClustalXVectorNTIOmiga，Bioxm，LaserGene，pcgene等第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物同源性分析用Blast軟件進行同源性比較盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物選擇3’端與非目的基因不同源的序列作為引物選擇兩個引物3’端與同一非目的基因不同源的序列作為引物第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日參數設置默認引物長度-默認值為25引物對搜索最大值-默認值為100核酸濃度-默認值為250pM單價離子濃度-默認值為50mM游離Mg2+離子濃度-默認值為1.5mM評分參數Ratingparameters

評分參數窗口是用來設定二級結構在引物評分中的權重系數二級結構越穩定引物評分就會越低相對于在引物中間形成的二級結構來說3末端的二級結構對PCR擴增的影響會更大為了將這一效應計算在內軟件將3末端的二級結構的自由能數值G減去1這一修正會使3末端的二級結構顯得更加穩定Primerpremier5.0使用介紹第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日參數設置第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日載入序列PreimerPremier啟動界面Loadsequence第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日粘貼序列窗口這一窗口使得一段核酸序列通過選擇以四種不同的方式粘貼上去（CTRL-V）第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日引物設計界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulin