第五節

核移植技術與克隆技術主講人：黃竹濤2015.4.19主要內容：細胞核移植技術

1）基本概念

2）核移植類型

3）核移植的一般操作程序

4）核移植的應用動物克隆1）克隆的基本原理2）影響克隆的因素3）體細胞克隆技術4）存在的問題一、核移植技術核移植技術：利用顯微操作技術將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中（同種或異種動物的去核成熟卵細胞），使后者不經精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發育,使得核供體的基因得到完全復制，從而創造無性雜交生物新品種的一項技術。1-1.基本概念供體細胞核的來源體細胞核移植胚胎細胞核移植胚胎干細胞核移植供受體種間關系異種核移植同種核移植核移植目的生殖性克隆治療性克隆1-2.核移植類型生殖性克隆治療性克隆細胞治療組織替代器官移植1-3.哺乳動物克隆操作技術生產克隆動物的主要方法有兩種：

1）胚胎分割

2）細胞核移植（動物克隆主要方式）

核移植克隆哺乳動物的技術操作過程主要包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、激活、重組胚的體外或體內培養、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步驟。核移植技術的一般操作程序1)核供體細胞的準備在核移植操作中，細胞核供體細胞首先必須是完整的二倍體，該細胞必須保持有供體動物完整的基因組；其次，供體細胞核必須能夠在受體細胞質的作用下，產生細胞分化過程的倒轉，變得如同剛剛受精的合子一樣，能重新完成從受精到發育成一個正常動物個體的全過程。

供體細胞主要有兩大類：胚胎卵裂球和體細胞。另外，核供體細胞的來源還有胚胎干細胞和胎兒成纖維細胞。

2)核受體細胞的準備

去核卵母細胞常常作為核移植的受體細胞這是因為在卵母細胞的細胞質含有某種特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表達程序發生重新排列，使已經分化了的細胞重新回到發育過程的原點，同受精卵一樣開始個體發育過程。

卵母細胞的來源有兩種方式：一是用激素對雌體進行超排處理，從輸卵管沖出體內成熟的MⅡ卵母細胞。二是從屠宰場收集卵巢，吸出濾泡中的卵丘—卵母細胞復合體(COCs)，在體外培養成熟后作為受體。去核方法：

1）Hochest染色法

2）時間控制去核法

3）化學去核法

4）2.5%蔗糖處理去核

5）末期去核法6）盲吸去核法3)細胞核移植

常用的核移植方法有兩種，即胞質內注射和透明帶下注射。胞質內注射是用一個外徑5～8μm的注核針吸取供體核后直接注射進卵母細胞胞質內的方法。透明帶下注射則是把供體細胞核注射在透明帶與卵母細胞之間的卵周隙中，核移植后用電刺激進行細胞融合。4）細胞核融合經透明帶下細胞核移植操作的卵子需要進行融合處理，才能使供體核進入受體胞質中，形成重構卵。

方法：化學融合——聚乙二醇處理仙臺病毒融合電融合——外加脈沖電場5)激活卵母細胞的激活涉及的因素很多，無論是受精引起的卵母細胞激活還是人工的激活，都會引起卵母細胞發生一系列的反應，這些反應是胚胎發育所必需的。其激活原理是通過電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細胞從MII期中解放出來，并轉到“受精”的狀態。電激法化學試劑法6）重組胚的體外培養

經融合和激活的重組胚體外培養，觀察重組胚的發育率。

7）胚胎移植

重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強、體格稍大的當地品種，進行同期發情處理，按常規方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發育到產仔。1-4.核移植技術的應用異種器官移植

可移植器官短缺豬的器官大小、結構和功能上與人體器官相近

急性免疫排斥反應基因敲除半乳糖基轉移酶核移植基因敲除SPF克隆豬器官移植生產藥用蛋白目的基因

轉基因細胞系核移植動物乳腺

乳液提取目的產

物基因打靶

保護瀕危物種細胞核去核卵母細胞核移植重構胚1)成功率低2)理論研究相對滯后3)體細胞克隆后代可能出現早衰，老化4)技術不夠完善1-5.核移植技術存在的問題2-1.克隆基本概念與原理

2-1.克隆基本概念與原理發育早期的動物胚胎細胞，或成年動物的體細胞，經顯微手術移植到去掉細胞核的卵母細胞中之后，在適當的條件下，可以重新發育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發育成為正常動物個體。經過核移植而產生的動物，其遺傳結構與細胞核供體完全相同。這種不經過有性生殖過程，而是通過核移植生產遺傳結構與細胞核供體相同動物個體的技術，就叫做動物克隆。2-2.影響哺乳動物克隆效果因素1.供受體細胞的同期處理2.受體細胞的因素

3.供體細胞的因素

4.重構胚激活因素、懷孕及其維持1.供受體細胞的同期處理M期（分裂期）：噻氨酯達唑或乙酰甲基秋水仙堿；G1期（DNA復制前期）：抑制DNA合成的藥物，如：阿菲迪霉素、羥基脲；G2期（DNA復制期）：放線菌酮；G0期誘導：血清饑餓法。

細胞周期對核移植成功率的影響至關重要。“多莉”誕生以后，其研究者認為，成功的關鍵因素之一是供體細胞經血清饑餓后，處于GO期，認為這種細胞易于重編程。

G0期：指具有分裂能力的組織中的細胞在反復分裂數次之后，處于停止分裂狀態的時期。供受體細胞所處的時期：對于受體細胞而言，其所處的階段對核移植后重構胚的發育至關重要；對于供體細胞而言，不同動物不同時期的胚胎具有不同的分化潛能，但是，如果核供體超過囊胚階段，則會影響重組胚的發育，如果超過了囊胚后期，則更多的細胞會發生不可逆的分化。

2.供體細胞核選擇的因素：（1）細胞類型：

KatoY等比較了牛同一個體卵母細胞和輸卵管細胞及不同個體體細胞：肝細胞、耳細胞、子宮細胞、表皮細胞、輸卵管細胞及卵母細胞對克隆效果的影響，結果認為牛卵丘／顆粒細胞和輸卵管細胞最適用于牛的核移植。（2）細胞傳代次數：細胞的傳代是否利于克隆個體方面的說法不一。但是大多數研究者使用的是原代培養或短期培養的細胞，認為這類細胞利于核移植胚的發育。

3.受體細胞的因素：

（1）盲吸去核法通常，盲吸法去核的時間選擇在第一極體剛排出時，因隨時間延長卵細胞核遠離第一極體，影響去核效率。此外，不同動物卵母細胞的結構特點不同，其盲吸法的去核效率也不同。

（2）化學誘導去核法與盲吸法等建立在顯微操作系統基礎之上的機械去核法相比，化學去核法程序簡單、機械損傷小、胞質丟失少、重復性好、適合大規模卵母細胞去核，具有很樂觀的應用前景。

卵母細胞要求完全去核，否則會形成多倍體影響發育。（3）MPF的作用

MPF（促卵成熟因子）是通過卵成熟誘發物質的作用在卵細胞質內所產生的因子，可促使卵核胞破壞實現卵成熟過程。將正在成熟的卵細胞質注射到未成熟的卵時，可看到被注射的卵被誘發成熟。通過卵成熟誘發物質所產生的少量促卵成熟因子在卵內廣泛增加，在到達一定濃度時，便引起卵母細胞成熟。卵細胞質中促卵成熟因子不具有特異性，所以可認為是普遍的細胞分裂開始的重要因子。卵母細胞的活化程度將影響胚胎的進一步發育，只有完全活化才能發育。

4.重構胚激活因素、懷孕及其維持：重構胚的激活是體細胞克隆技術的關鍵環節，體細胞克隆胚胎的充分激活是保證胚胎正常發育的先決條件，只有在去核卵母細胞充分激活的情況下才可以指導移人的核發生重編程。

可以通過將重組胚放在結扎羊的輸卵管中培育一段時間的方法，或者在體外將其與輸卵管上皮細胞培養的的方法來促使其激活并發育。注意移植重組胚的時間及維持其妊娠。生物學意義：1)提高動物無性繁殖能力：擴大優良品種，挽救瀕危物種。2）促進對細胞核、細胞質與遺傳關系的研究3）探索控制腫瘤細胞和癌細胞核的活動機理：研究其基因調控，為治療提供依據。4）生物制藥：活體藥物工廠。CattleGoatsMicePigsGaurCatSheep1996199819981996200120002001克隆動物照片HorseDeerMulesRatsDog20032003200520032003體細胞克隆牛理論問題分化的體細胞克隆對遺傳物質重編（細胞核內所有或大部分基因關閉，細胞重新恢復全能性的過程）的機理還不清楚；克隆動物是否會記住供體細胞的年齡。克隆動物的連續后代是否會累積突變基因。在克隆過程中胞質線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。2-3.克隆技術存在的問題實踐問題克隆動